Scientific Publications - Work Done by Microbiology Reader Bioscreen C

Monica Toldra i Alegret,
Revaloracio  de la fraccio cellular  de la sang de porc procedent  d'escorxadors industrials, Tesi Doctoral 2002, Universitat de Girona, Departament d'Enginyeria Quimica, Agraria i Tecnologia Agroalimentaria, Institut de Tecnologia Agroalimentaria

Agraïments

Vull expressar el meu sincer agraïment a totes aquelles persones i entitats que han fet possible la realització d’aquest treball. En primer lloc a la Dra. Carme Carretero, directora d’aquesta tesi, per haver confiat en mi i haver-me estimulat, introduït i guiat en la recerca. Per la seva supervisió i dedicació, pels seus consells savis, explicacions i l’aclariment de dubtes. Pel suport que m’ha donat durant tot el temps que ha durat la part experimental i durant la redacció, fins i tot en moments dolents o sota tensió pels nervis de l’últim moment. També vull agrair-li el seu recolzament, els ànims i que sempre m’ha encoratjat a tirar endavant i molt especialment, la minuciosa revisió i correcció del text. Moltes gràcies, jefa!

A les companyes i companys de Tecnologia dels Aliments, per tot el que hem compartit i pel seu suport: “las chicas de Tecno” Dolors, Anna Maria, Lucero, Elena i Carme, als antics companys Ferran Ribas i Joan de Gracia i als nous de “Molecular” Maria Pla i David Rodríguez. A la Dolors Parés m’agradaria agrair-li el seu recolzament, la seva dedicació, paciència i, des del principi, haver-me ensenyat tantes coses del treball al laboratori, tècniques analítiques, informàtica, estadística, interpretació de resultats, etc. Pels seus bons consells i per fer-me de "germana" gran i d’amiga. A l’Elena Saguer, per la seva col·laboració en la part experimental i la gran ajuda amb el SAS, per aclarir-me molts dubtes relacionats amb el tractament estadístic de les dades (ets una crack) i per compartir el despatx. A l’Anna Maria Aymerich, moltes gràcies per la teva ajuda en la part experimental, preparació de reactius, comandes, recollida de mostres de sang a l’escorxador, viatges a la UAB, etc. Per les bones estones que ens han alegrat la feina, pel teu suport als moments dolents i per la teva amistat i generositat. Què faríem sense tu? Saps el què et vull dir? A la Lucero Zamora, per compartir el despatx, ordinadors, material, equips del laboratori, bromes, bogeria sana, per riure juntes, pel seu suport, la seva amistat i generositat durant tot aquest temps. Pel seu recolzament i per ser tan bona gent. Gràcies Ranchera i molta sort amb els làctics! A la Rebeca Jiménez, per la seva gran ajuda al laboratori amb els hidrolitzats, pel seu suport, per saber escoltar i tenir sempre un bon consell a ma. Et trobarem molt a faltar!…pero nos vemos en Aguatulco (espero). Als companys del Departament d’EQATA i de l’INTEA per compartir espais, equips, material, etc. i per les bones estones que hem passat junts, sobretot al menjador: Anna (per la seva amistat i amabilitat), Nuri (per ser tan guai, la millor companya de pis i pels dinars de l’àvia dels dilluns), Mª Àngels (el teu somriure anima molt), Esther (Hola reina!), Isidre, Cun, Jordi Cabrefiga, Jesús, Ferran, Jaume, Joan XlaP (per la seva gran ajuda amb la informàtica i les ANN), Lídia, Lusi, Olga, Sussi, Rosa, Gemma, Jordi Cervantes, Josep Lluís, Marta Gou, Fabiola, Sussana Presta, Farnés, Mari Carmen, Marta Pujol, Elena Fulladosa.

Als companys de PV, Anna, Isidre i Cun, per resoldre’m molts dubtes de l’ANOVA i el JMP, a l’Esther i al Jordi per la seva inestimable ajuda amb el bioscreen, les fotos, l’escàner, l’analitzador d’imatges pels gels, etc. Al Josep Pereda, pels seus súper muntatges i invents. A la Sussi Santaulària, Carme Dilmé, Lourdes Coderch, Alda Carreras i Cristina Núñez, per la seva gran ajuda en diversos aspectes administratius i burocràtics.

També estic molt agraïda als TFCs: Esther Busquets, Ferran Piferrer, Pere Felip, Anna Busquets, Cristina Santamaria, Judit Capdevila, Arnau Elias, Carles Lorca i Sergi Altarriba, per la seva gran col·laboració en diverses parts d’aquest treball durant el desenvolupament dels seus projectes final de carrera. També a l’Elisabet Sànchez, Manel Duran, Sergi Turon, Maria Guajardo, Sergi Carreras i Aurora Piñero per compartir el laboratori durant el temps que han estat entre nosaltres.

A l’Institut de Tecnologia Agroalimentària (INTEA) i al Departament d’Enginyeria Química, Agrària i Tecnologia Agroalimentària (EQATA) de la Universitat de Girona per haver-me proporcionat les instal·lacions i els mitjans necessaris per a dur a terme aquest treball. Al Dr. Emili Montesinos, per deixar-me utilitzar el Bioscreen, el JMP del Machintosh, etc. Al Dr. Joan Saurina del Departament d'Enginyeria Industrial de la UdG per deixar-nos utilitzar l'equip DSC. Al Dr. Buenaventura Guamis del Centre Especial de Recerca-Planta de Tecnologia dels Aliments de la Facultat de Veterinària de la UAB, per deixar-nos utilitzar l’equip HHP. Al Josep Yuste (Yuyu) i al Joan Miquel per la seva amable ajuda amb els tractaments HHP. A l’escorxador Frigorífics Costa Brava que ens ha facilitat les mostres de sang utilitzades en l'estudi i a l’empresa Novozymes, per haver-nos donat gentilment els enzims. I als meus pares, al meu germà i als amics, MOLTES GRÀCIES per tot. A tots ells el meu agraïment.

El treball que representa aquesta memòria s’ha realitzat en el marc de les ajudes a Grups de Recerca Consolidats de Catalunya (SGR) de la Generalitat de Catalunya amb Refs. 1998SGR00093, 2000SGR00095 i 2001SGR000293, amb fons del Centre de Referència en Tecnologia dels Aliments (CeRTA) de la Comissió Interdepartamental de Recerca i Innovació Tecnològica (CIRIT) de la Generalitat de Catalunya destinats a la Unitat de Tecnologia Agroalimentària (TAG) pel projecte “Aprofitament de subproductes de la Indústria carnia” i amb el finançament del projecte “Desarrollo de ingredientes alimentarios a partir de fracciones de sangre de cerdo sometidas a alta presión hidrostática” amb Ref. ALI99-1055-C02-01 del Programa Nacional de I+D+I de la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnologia (CICYT).

I

Índex

Capítol 1 Introducció 3

1.1 Els subproductes de la indústria càrnia 3

1.2 La sang de porc 5

1.3 Revaloració i aprofitament de la sang 6

1.3.1 Sistemes de recollida de la sang a l’escorxador 8

1.3.1.1 Sang veterinària 8

1.3.1.2 Sang higiènica 8

1.3.2 Valor nutritiu de la sang 10

1.3.3 Propietats funcionals de la sang 10

1.4 Fracció plasmàtica 11

1.5 Fracció cel·lular 12

1.5.1 L’hemoglobina 13

1.5.2 Valor nutritiu de l’hemoglobina i la globina 15

1.5.3 Propietats funcionals de l’hemoglobina i la globina 15

1.5.4 Utilització de la fracció cel·lular 16

1.6 Objectius generals i estructuració del treball 17

Capítol 2 Conservació de la fracció cel·lular mitjançant la deshidratació per atomització i caracterització del producte en pols 21

2.1 INTRODUCCCIÓ 21

2.2 OBJECTIUS 23

2.3 MATERIAL I MÈTODES 24

2.3.1 Disseny experimental 24

2.3.2 Procedència de les mostres de sang 26

2.3.3 Obtenció de la fracció cel·lular hemolitzada en pols 26

2.3.3.1 Obtenció de la fracció cel·lular 26

2.3.3.2 Hemòlisi de la fracció cel·lular 27

2.3.3.3 Deshidratació per atomització de la fracció cel·lular hemolitzada 28

2.2.4 Determinació de les condicions del procés de deshidratació per atomització de la fracció cel·lular hemolitzada 29 

2.2.4.1 Contingut en humitat 31

2.2.4.2 Solubilitat proteica 31

2.2.4.3 Anàlisi calorimètrica per DSC 31

2.2.5 Caracterització microbiològica de la fracció cel·lular 33

2.2.5.1 Recompte de microorganismes aerobis mesòfils 33

2.2.5.2 Recompte de Staphylococcus aureus 34

2.2.5.3 Recompte de Clostridis sulfit reductors 34

2.2.6 Caracterització físico-química de la fracció cel·lular hemolitzada i deshidratada per atomització 35

2.2.6.1 Composició química de la fracció cel·lular en pols 35

2.2.6.2 Caracterització dels paràmetres de color de la fracció cel·lular en pols 36

2.2.7 Activitat de l’aigua i isotermes de sorció de la fracció cel·lular hemolitzada i deshidratada per atomització 38

2.2.7.1 Determinació de l’activitat de l’aigua 38

2.2.7.2 Determinació experimental de les isotermes de sorció 40

2.2.7.3 Isoterma d’adsorció de la fracció cel·lular deshidratada per atomització segons el model GAB (Guggenheim-Anderson-De Boer) 41

2.2.8 Tractament estadístic de les dades 42

2.4 RESULTATS I DISCUSSIÓ 43

2.4.1 Determinació de les condicions de deshidratació per atomització de la fracció cel·lular de la sang de porc 43

2.4.1.1 Contingut en humitat en funció de la temperatura de deshidratació 43

2.4.1.2 Influència de la temperatura de deshidratació sobre la solubilitat proteica 45

2.4.1.3 Anàlisi calorimètrica de la fracció cel·lular per DSC 47

2.4.1.4 Discussió global de la determinació de les condicions de deshidratació de la fracció cel·lular per atomització 52

2.4.2 Caracterització microbiològica de la fracció cel·lular 52

2.4.2.1 Recompte de microorganismes aerobis mesòfils viables 53

2.4.2.2 Investigació i recompte de Staphylococcus aureus 56

2.4.2.3 Investigació i recompte de Clostridis sulfit reductors 58

2.4.2.4 Discussió global de la caracterització microbiològica de la FC en pols 59

2.4.3 Caracterització físico-química de la fracció cel·lular hemolitzada i deshidratada per atomització 60

2.4.3.1 Composició química de la fracció cel·lular en pols 60

2.4.3.2 Caracterització dels paràmetres del color de la fracció cel·lular en pols 62

2.4.4 Activitat de l’aigua i isotermes de sorció de la fracció cel·lular hemolitzada i deshidratada per atomització 63

2.5 CONCLUSIONS 77

Capítol 3 Estabilització del color de la fracció cel·lular deshidratada

per atomització per utilitzar-la com a colorant alimentari 81

3.1 INTRODUCCCIÓ 81

3.2 OBJECTIUS 83

3.3 MATERIAL I MÈTODES 83

3.3.1 Disseny experimental 83

3.3.2 Addició dels antioxidants a la fracció cel·lular i deshidratació de les mostres per atomització 84

3.3.3 Determinació del color 85

3.3.4 Tractament estadístic de les dades 85

3.4 RESULTATS I DISCUSSIÓ 85

3.4.1 Efecte de l’addició d’àcid ascòrbic 85

3.4.2 Efecte de l’addició de dextrina 90

3.4.3 Efecte de l’addició de glucosa 92

3.4.4 Efecte de l’addició de L-cisteïna 94

3.4.5 Efecte de l’addició d’àcid nicotínic 98

3.4.6 Efecte de l’addició de nicotinamida 101

3.5 CONCLUSIONS 103

Capítol 4 Higienització de la fracció cel·lular mitjançant el tractament

amb altes pressions hidrostàtiques 107

4.1 INTRODUCCCIÓ 107

4.2 OBJECTIUS 110

4.3 MATERIAL I MÈTODES 111

4.3.1 Procedència de les mostres 111

4.3.2 Tractament amb altes pressions hidrostàtiques 111

4.3.3 Contaminació microbiològica 113

4.3.3.1 Recompte de microorganismes aerobis mesòfils 113

4.3.3.2 Capacitat de creixement de la microbiota contaminant 113

4.3.4 Color CIE L*a*b* 114

4.3.5 Solubilitat proteica 114

4.3.6 Viscositat 115

4.3.7 Determinació de les propietats funcionals 115

4.3.7.1 Solubilitat proteica 117

4.3.7.2 Capacitat escumant i estabilitat de l’escuma 117

4.3.7.3 Activitat emulsionant 118

4.3.7.4 Formació de pastes per escalfament 118

4.3.8 Anàlisi estadística de les dades 120

4.4 RESULTATS I DISCUSSIÓ 121

4.4.1 Efectes del tractament HHP sobre la microbiota contaminant de la fracció cel·lular 127

4.4.2 Efectes del tractament HHP sobre els paràmetres CIE L*a*b* del color de la fracció cel·lular 130

4.4.3 Efectes del tractament HHP sobre la solubilitat proteica de la fracció cel·lular 133

4.4.4 Efectes del tractament HHP sobre la reologia de la fracció cel·lular 136

IV

4.4.5 Propietats funcionals de la fracció cel·lular higienitzada per altes pressions i deshidratada per atomització 138

4.4.5.1 Solubilitat proteica 140

4.4.5.2 Capacitat escumant i estabilitat de l’escuma 141

4.4.5.3 Activitat emulsionant 145

4.4.5.4 Textura (TPA) i capacitat de retenció d’aigua (CRA) de les pastes obtingudes per escalfament 148

4.5 CONCLUSIONS 152

Capítol 5 Obtenció d’hidrolitzats proteics descolorats a partir de la

fracció cel·lular 157

5.1 INTRODUCCCIÓ 157

5.2 OBJECTIUS 161

5.3 MATERIAL I MÈTODES 162

5.3.1 Procedència de les mostres 162

5.3.2 Enzims proteolítics utilitzats per hidrolitzar l’hemoglobina 162

5.3.3 Hidròlisi enzimàtica 164

5.3.4 Grau d’hidròlisi 165

5.3.5 Percentatge de nitrogen no proteic 167

5.3.6 Experiments preliminars 167

5.3.7 Aplicació de l’alta pressió hidrostàtica sobre l’obtenció d’hidrolitzats proteics de la fracció cel·lular 169

5.3.7.1 Disseny experimental 169

5.3.7.2 Caracterització dels hidrolitzats 171

5.3.7.3 Anàlisi dels pèptids obtinguts als hidrolitzats proteics mitjançant electroforesi SDS-PAGE 171

5.3.8 Deshidratació per atomització dels hidrolitzats T+P de la fracció cel·lular 173

5.3.9 Caracterització físico-química i microbiològica dels hidrolitzats T+P d’hemoglobina 174

5.3.10 Determinació de les propietats funcionals dels hidrolitzats T+P d’hemoglobina deshidratats per atomització 175

5.3.11 Tractament estadístic de les dades 176

5.4 RESULTATS I DISCUSSIÓ 176

5.4.1 Experiments preliminars per a l’obtenció d’hidrolitzats a partir de l’Hb 176

5.4.2 Efectes de l’aplicació de l’alta pressió hidrostàtica sobre l’obtenció d’hidrolitzats proteics de l’Hb 180

5.4.3 Deshidratació per atomització dels hidrolitzats T+P de fracció cel·lular 187

5.4.4 Caracterització físico-química i microbiològica dels hidrolitzats T+P de FC deshidratats per atomització 189

5.4.5 Propietats funcionals dels hidrolitzats T+P de FC deshidratats per atomització 192

V

5.4.5.1 Solubilitat proteica 192

5.4.5.2 Capacitat escumant i estabilitat de l’escuma 194

5.4.5.3 Activitat emulsionant 196

5.5 CONCLUSIONS 199

Conclusions del treball 205

Bibliografia 211

Annexos 227

Annex 1: Conservació de la fracció cel·lular mitjançant la deshidratació i caracterització del producte en pols 227

Annex 2: Estabilització del color de la fracció cel·lular deshidratada per atomització per utilitzar-la com a colorant alimentari 229

Annex 3: Higienització de la fracció cel·lular mitjançant el tractament amb altes pressions hidrostàtiques 233

Annex 4: Obtenció d’hidrolitzats proteics descolorats a partir de la fracció cel·lular 243

VI

Llliisttatt de Fiigurres

Capítol 1: Introducció

Figura 1.1: Diferents fraccions de la sang. 5

Figura 1.2: Sistema de recollida higiènica de la sang d’escorxador i detall del ganivet utilitzat. 9

Figura 1.3: Fotografia SEM dels eritròcits de la fracció cel·lular de la sang. 13

Figura 1.4: Diagrama esquemàtic de l’hemoglobina mostrant l’estructura dels grups hemo associats. 14

Figura 1.5: Formes de l’hemoglobina en funció de l’estat del grup hemo i de la concentració d’oxigen, mostrant el color característic de cadascuna. 14

Capítol 2: Conservació de la fracció cel·lular mitjançant la deshidratació per atomització i caracterització del producte en pols

Figura 2.1: Esquema de l’equip de deshidratació per atomització 29

Figura 2.2: Diagrama de flux del procés tecnològic d’obtenció de la FC hemolitzada (concentrat d’Hb) deshidratada per atomització. 30

Figura 2.3: Representació tridimensional del sòlid de color segons l'espai de color CIE L*a*b*. 37

Figura 2.4: Diagrama de Cromaticitat a*, b* que representa la visió d'un tall horitzontal del sòlid de color a un valor de L* constant. 37

Figura 2.5: Esquema del dispositiu utilitzat per a la determinació de l’aw i de les isotermes de sorció pel mètode gravimètric. 39

Figura 2.6: Percentatge d’humitat de la FC deshidratada (g d’aigua per 100 g de pols) en funció de la temperatura de deshidratació. 44

Figura 2.7: Solubilitat proteica (%) a pH 7,5 de la FC en pols en funció de la temperatura de deshidratació. 47

Figura 2.8: Termogrames obtinguts per DSC de mostres de 100 mL de FC fresca de sang de porc i de FC en pols deshidratades per atomització a diferents temperatures. 48  

Figura 2.9: Recompte de microorganismes aerobis mesòfils de la FC fresca, FC hemolitzada per ultrasons i FC hemolitzada i deshidratada per atomització. 54 

Figura 2.10: Recomptes de S. aureus de la FC hemolitzada i a la FC hemolitzada i deshidratada per atomització. 57

Figura 2.11: Recomptes de clostridis sulfit reductors de la FC hemolitzada i a la FC hemolitzada i deshidratada per atomització. 59

VII

Figura 2.12: Representació de les velocitats relatives d’alteració dels aliments en funció de l’aw i les propietats de sorció d'humitat dels productes alimentaris. 67

Figura 2.13: Representació esquemàtica de les isotermes de sorció mostrant el fenomen de la histèresi. 69

Figura 2.14: Isotermes de sorció a 20ºC de la FC hemolitzada i deshidratada per atomització a 140ºC. 72

Figura 2.15: Relació entre aw/m i l’aw (a 20ºC) de la FC hemolitzada i deshidratada per atomització a 140ºC per calcular els coeficients de regressió a, b i g. 74

Figura 2.16: Isoterma d’adsorció a 20ºC de la FC hemolitzada i deshidratada per atomització a 140ºC obtinguda segons el model GAB (Guggemhein, Anderson i De Boer). 75

Capítol 3: Estabilització del color de la fracció cel·lular deshidratada per atomització per utilitzar-la com a colorant alimentari

Figura 3.1: Evolució del paràmetre L* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració d’àcid ascòrbic. 87

Figura 3.2: Evolució del paràmetre a* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració d’àcid ascòrbic. 88

Figura 3.3: Evolució del paràmetre b* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració d’àcid ascòrbic. 88

Figura 3.4: Evolució del paràmetre L* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració de dextrina. 90

Figura 3.5: Evolució del paràmetre a* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració de dextrina. 91

Figura 3.6: Evolució del paràmetre b* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració de dextrina. 91

Figura 3.7: Evolució del paràmetre L* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració de glucosa. 93

Figura 3.8: Evolució del paràmetre a* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració de glucosa. 93

Figura 3.9: Evolució del paràmetre b* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració de glucosa. 94

Figura 3.10: Evolució del paràmetre L* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració de L-Cisteïna. 95

Figura 3.11: Evolució del paràmetre a* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració de L-Cisteïna. 96

VIII

Figura 3.12: Evolució del paràmetre b* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració de L-Cisteïna. 96

Figura 3.13: Evolució del paràmetre L* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració d’àcid nicotínic. 98

Figura 3.14: Evolució del paràmetre a* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració d’àcid nicotínic. 99

Figura 3.15: Evolució del paràmetre b* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració d’àcid nicotínic. 100

Figura 3.16: Evolució del paràmetre L* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració de nicotinamida. 101

Figura 3.17: Evolució del paràmetre a* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració de nicotinamida. 102

Figura 3.18: Evolució del paràmetre b* en el temps del concentrat d’Hb en pols en funció de la concentració de nicotinamida. 102

Capítol 4: Higienització de la fracció cel·lular mitjançant el tractament amb altes pressions hidrostàtiques

Figura 4.1: Esquema d’un equip discontinu d’alta pressió hidrostàtica. 110

Figura 4.2: Mostres de fracció cel·lular hemolitzada envasades abans del tractament HHP i detall del cilindre de pressurització de la premsa isostàtica discontínua utilitzada. 112

Figura 4.3: Corba estàndard d’un assaig de TPA on es mostren els diferents paràmetres calculats. 120

Figura 4.4: Recomptes de microorganismes mesòfils de la FC no tractada (control), de la FC sotmesa a 400 MPa, a 20 i 40ºC durant 5 i 15 minuts i de la FC sotmesa a 450 MPa a 20ºC durant 5 min. 122

Figura 4.5: Corbes de creixement a 31ºC dels microorganismes de la FC hemolitzada no tractada (control) i de la FC sotmesa a 400 MPa i a 20ºC durant 5, 15 i 30 minuts. 123

Figura 4.6: Temps de detecció (hores) del creixement de la microbiot a contaminant de la FC no tractada (control) i la FC sotmesa a 400 MPa i a 20 ºC durant 5, 15 i 30 minuts. 124

Figura 4.7: Recomptes de microorganismes aerobis mesòfils de la FC no tractada (control) i de la FC sotmesa a 400 MPa a 20ºC durant 5, 15 i 30 minuts. 125

Figura 4.8: Solubilitat a pH 7 i a pH 4,5 de la FC no tractada (control) i de la FC sotmesa a 400 MPa i a 20ºC durant 5, 15 i 30 minuts. 125

Figura 4.9: Viscositat a 25ºC de la FC no tractada (control) i de la FC sotmesa a 400 MPa a 20ºC durant 5, 15 i 30 minuts. 126

IX

Figura 4.10: Esquema del procediment experimental dut a terme per establir les condicions òptimes de temperatura i temps per aplicar el tractament HHP a 400 MPa a la fracció cel·lular hemolitzada. 126

Figura 4.11: Recomptes de microorganismes aerobis mesòfils de la FC no tractada (control) i de la FC sotmesa a 400 MPa en funció de la temperatura (5, 20 i 40ºC) i el temps (5 i 15 minuts) de tractament. 127

Figura 4.12: Corbes de creixement a 31ºC dels microorganismes de la FC hemolitzada no tractada (control) i de la FC sotmesa a 400 MPa, a 5, 20 i 40ºC durant 5 i 15 minuts. 129

Figura 4.13: Solubilitat proteica a pH 7 i a pH 4,5 de la FC hemolitzada no tractada (control) i de les mostres de FC sotmeses a 400 MPa a tres temperatures (5, 20 i 40ºC) durant 5 i 15 minuts. 134

Figura 4.14: Representació esquemàtica del diagrama de fase pressió/temperatura per a la desnaturalització de les proteïnes. 135

Figura 4.15: Viscositat a 25ºC de la FC hemolitzada no tractada (control) i de la FC sotmesa a 400 MPa a tres temperatures (5, 20 i 40ºC) durant 5 i 15 minuts. 137

Figura 4.16: Recomptes de microorganismes aerobis mesòfils de la FC no tractada (control) i de la FC tractada per HHP, abans i després de la deshidratació per atomització. 139

Figura 4.17: Solubilitat proteica (%) a pH 4,5 i pH 7 de la FC tractada per HHP i la FC no tractada (control) deshidratades per atomització. 141

Figura 4.18: Capacitat escumant (volum escuma en mL) a pH 4,5 i pH 7 de la FC tractada per HHP i la FC no tractada (control) deshidratades per atomització. 142

Figura 4.19: Estabilitat de l’escuma (%) a pH 4,5 i pH 7, formada amb FC tractada per HHP i FC no tractada (control) deshidratades per atomització. 144

Figura 4.20: Activitat emulsionant (absorbància a 500 nm) a pH 4,5 i pH 7 de la FC tractada per HHP i la FC no tractada (control) deshidratades per atomització en funció de la concentració de FC (p/v). 146

Figures 4.21 A, B i C: Paràmetres del TPA de les pastes obtingudes a pH 4,5 i pH 7 amb FC tractada per HHP i FC no tractada (control) en pols. 150

Figura 4.22: Capacitat de retenció d’aigua (% d’aigua retinguda) a pH 4,5 i pH 7 de les pastes obtingudes amb FC tractada per HHP i FC no tractada (control) deshidratades per atomització. 151

Capítol 5: Obtenció d’hidrolitzats proteics descolorats a partir de la fracció cel·lular

Figura 5.1: Muntatge utilitzat per dur a terme les reaccions d’hidròlisi enzimàtica de la FC. 165

Figura 5.2: Esquema del procediment experimental dut a terme per determinar els efectes de l’aplicació del tractament HHP (400 MPa, 20ºC, 15 min) sobre l’obtenció d’hidrolitzats descolorats d’Hb a partir de la FC. 170

X

Figura 5.3: Diagrama de flux del procés d’obtenció dels hidrolitzats trípsics i pèpsics d’hemoglobina deshidratats per atomització. 174

Figura 5.4: Sobrenedant recuperat (%) després de la centrifugació dels hidrolitzats obtinguts mitjançant Tripsina (T), Tripsina i Pepsina (T+P), i Alcalasa (A) a partir de FC sotmesa a altes pressions abans (HP+E) i després (E+HP) de l’addició dels enzims. 181

Figura 5.5: Grau d’hidròlisi (%) de la FC no tractada (control) i dels hidrolitzats de FC sotmesa al tractament HHP abans (HP+E) i després (E+HP) de l’addició dels enzims. 182

Figura 5.6: Percentatge de NNP de la FC no tractada (control) i dels hidrolitzats de FC sotmesa al tractament HHP abans (HP+E) i després (E+HP) de l’addició dels enzims. 182

Figura 5.7: Gels SDS-PAGE dels hidrolitzats proteics d’hemoglobina. 184

Figura 5.8: Percentatge d’humitat (%) dels hidrolitzats T+P d’Hb deshidratats per atomització en funció de la temperatura. 187

Figura 5.9: Solubilitat proteica (%) a pH 5 de l’hidrolitzat T+P d’Hb líquid (control) i dels hidrolitzats en pols en funció de la temperatura de deshidratació. 188

Figura 5.10: Mostres de FC no hidrolitzada (control) i de l’hidrolitzat proteic d’Hb mitjançant Tripsina+Pepsina deshidratats per atomització. 190

Figura 5.11: Recomptes totals de la FC hemolitzada (control) i de l’hidrolitzat trípsic i pèpsic d’Hb abans i després de la deshidratació. 191

Figura 5.12: Solubilitat proteica a pH 5 i pH 7 de l’hidrolitzat trípsic i pèpsic d’Hb en estat líquid i deshidratat. 193

Figura 5.13: Capacitat escumant (mL d’escuma) a pH 5 i 7 de l’hidrolitzat trípsic i pèpsic d’Hb en pols. 195

Figura 5.14: Estabilitat de l’escuma (%) a pH 5 i 7 de l’hidrolitzat trípsic i pèpsic d’Hb en pols. 196

Figura 5.15: Activitat emulsionant a t=0 i t=10 min (absorbància a 500 nm) a pH 5 i 7, de l’hidrolitzat trípsic i pèpsic d’Hb en pols. 197

XI

Llliisttatt de Taulles

Capítol 1: Introducció

Taula 1.1: Subproductes d’origen animal i possibles aplicacions. 4

Taula 1.2: Composició de les fraccions de la sang. 6

Taula 1.3: Aplicacions de la sang. 7

Taula 1.4: Propietats funcionals de les proteïnes de les fraccions la sang. 11

Taula 1.5: Composició química de la fracció cel·lular de la sang de porc. 12

Taula 1.6: Composició en aminoàcids essencials de l’hemoglobina i la globina, obtinguda per diferents mètodes. 15

Capítol 2: Conservació de la fracció cel·lular mitjançant la deshidratació per atomització i caracterització del producte en pols

Taula 2.1: Activitats de l’aigua i humitats relatives en l’equilibri a 20ºC de les solucions saturades de les sals utilitzades en la determinació de l’activitat de l’aigua de la FC en pols. 39

Taula 2.2: Activitats de l’aigua i humitats relatives en l’equilibri a 20ºC de les solucions saturades de les sals utilitzades per determinar les isotermes de sorció de la FC en pols. 40

Taula 2.3: Propietats tèrmiques de la FC fresca, de la FC en pols en funció de la temperatura de deshidratació per atomització i d’un patró d’Hb de sang de porc obtingudes per DSC.  51

Taula 2.4: Composició química de la fracció cel·lular en pols. 61 Taula 2.5: Valors dels components CIE L*a*b* del color i la Saturació (C*) de la FC hemolitzada i deshidratada per atomització a 140ºC. 63

Taula 2.6: Valors d’activitat de l’aigua segons els aliments. 65 Taula 2.7: Efecte de l’aw sobre el creixement i la producció de toxines de diferents espècies de microorganismes patògens en aliments. 66

Taula 2.8: Activitats de l'aigua (aw) a 20ºC de les mostres A, B i C de FC deshidratada per atomització a 140ºC determinades pel mètode de la interpolació gràfica, i coeficients de regressió de les rectes. 71

Taula 2.9: Contingut en humitat en l’equilibri de la FC hemolitzada i deshidratada per atomització a 140ºC en funció de l’aw a 20ºC. 71

Taula 2.10: Coeficients de regressió i equació polinòmica de segon grau obtinguts a partir de la representació de l’aw/m en funció de l’aw; les constants i l’equació del model GAB. 75

XII

Capítol 4: Higienització de la fracció cel·lular mitjançant el tractament amb altes pressions hidrostàtiques

Taula 4.1: Percentatges d’humitat (g d’aigua per 100 g de pols) de les 5 mostres de FC no tractades (control) i pressuritzades deshidratades per atomització a 140ºC, i temperatures de sortida de l’aire durant la deshidratació. 116

Taula 4.2: Velocitat de creixement i temps de generació de la microbiota contaminant de la FC hemolitzada no tractada (control) i de la població bacteriana supervivent en la FC sotmesa a 400 MPa en funció de la temperatura (5, 20 i 40ºC) i el temps (5 i 15 minuts) de tractament. 129

Taula 4.3: Paràmetres CIE L*a*b* del color de la FC hemolitzada no tractada (control) i de les mostres de FC sotmeses a 400 MPa en funció de la temperatura (5, 20 i 40ºC) i el temps (5 i 15 minuts) de tractament. 131

Taula 4.4: Valors dels paràmetres CIE L*a*b* del color de la FC no tractada (control) i la FC tractada per HHP deshidratades per atomització. 140

Taula 4.5: Percentatge d’escuma (%) als 60, 90 i 120 min de repòs, obtinguda a partir de FC tractada per HHP i FC no tractada (control) deshidratades per atomització, en funció del pH. 144

Capítol 5: Obtenció d’hidrolitzats proteics descolorats a partir de la fracció cel·lular

Taula 5.1: Enzims proteolítics utilitzats en l’obtenció d’hidrolitzats proteics de l’hemoglobina i condicions òptimes de reacció. 163

Taula 5.2: Condicions de reacció dels tractaments d’obtenció d’hidrolitzats mitjançant Tripsina (T), Tripsina i Pepsina (T+P), i Alcalasa (A) a partir de FC sotmesa al tractament HHP abans i després de l’addició dels enzims. 170

Taula 5.3: Percentatge de sobrenedant després de la centrifugació, grau d’hidròlisi, nitrogen no proteic i grau de descoloració als sobrenedants de les solucions d’hidrolitzats d’Hb obtinguts mitjançant diferents enzims proteolítics i condicions d’hidròlisi. 177

Taula 5.4: Pes molecular estimat i percentatge de cada banda dels diferents pèptids que composen els hidrolitzats proteics d’Hb obtinguts mitjançant hidròlisi amb Tripsina (T), Tripsina seguit de Pepsina (T+P), i Alcalasa (A) a partir de FC sotmesa al tractament HHP abans i després de l’addició dels enzims i de la FC no hidrolitzada (control). 185

Taula 5.5: Característiques de les espècies produïdes en la hidròlisi enzimàtica de proteïnes. 186

Taula 5.6: Valors dels paràmetres CIE L*a*b* del color dels hidrolitzats trípsics i pèpsics d’Hb deshidratats per atomització en funció de la temperatura. 189

Taula 5.7: Composició química dels hidrolitzats T+P d’Hb deshidratats per atomització. 189

Taula 5.8: Valors dels paràmetres CIE L* , a* i b* del color de l’hidrolitzat trípsic i pèpsic d’Hb deshidratat per atomització. Es mostren els paràmetres del color de la fracció cel·lular no tractada (control) en pols. 191

XIII

Capítol 1 3

Capítol 1: Introducció

1.1 Els subproductes de la indústria càrnia

En qualsevol procés tecnològic de conservació i/o transformació dels aliments, a part del producte principal, s’obtenen una sèrie de productes secundaris: els subproductes i residus, que en alguns casos poden tenir un interès industrial. Els subproductes són tots aquells productes amb un valor econòmic potencial, excloent la canal i les despulles, derivats del sacrifici de l’animal (Boorem i Weis, 1988). En canvi, es consideren com a residus, els productes que resten després del procés industrial que per la seva naturalesa o per aspectes econòmics no es solen aprofitar. De manera que, per exemple, la sang obtinguda per un escorxador durant el sacrifici s’ha de considerar un subproducte, mentre que el pèl del porcí generat en un escorxador és un residu (Collado, 1995). A les indústries alimentàries, especialment a les del sector carni, es generen grans volums de subproductes i residus, els quals augmenten tant les despeses econòmiques derivades del seu tractament i eliminació, com les ambientals, ja que en la majoria dels casos es tracta de productes amb un elevat contingut en matèria orgànica que cal sotmetre a varis tractaments físico-químics de depuració abans del seu abocament. El primer objectiu de la indústria càrnia és l’obtenció de la canal a partir de l’animal viu a l’escorxador. Després, a les sales de desfer i a les indústries elaboradores, es produiran les successives transformacions per obtenir la carn fresca i un ampli ventall de productes carnis derivats (frescos, cuits, curats, fermentats, etc.). Aquestes indústries generen grans quantitats de subproductes i/o residus (Taula 1.1), amb unes característiques físico-químiques molt diverses que, en alguns casos, poden superar fins i tot el 50 % del pes inicial (Ockerman i Hansen, 1994).

És molt interessant trobar estratègies que permetin l'aprofitament i revaloració dels subproductes d’origen animal. En cas contrari, es perd un gran potencial alimentari i, a més, la indústria càrnia té la responsabilitat d’evitar i disminuir la contaminació. Cal doncs aprofitar de manera racionalitzada el recurs natural que constitueixen els animals d’abast, així com els subproductes que es generen de la seva transformació industrial. Molts dels subproductes són una font molt important de vitamines i minerals i presenten una composició en aminoàcids semblant a la de la carn. Però existeixen altres productes que competeixen amb els subproductes carnis, com les proteïnes de la llet i de la soja, cereals i midons, que sovint tenen menor cost, millors propietats funcionals, i major estabilitat i acceptabilitat per part dels consumidors (Goldstrand, 1988). Els principals factors que influencien la utilització dels subproductes són el seu valor nutritiu, requeriments sanitaris, que siguin competitius al mercat des del punt de vista econòmic i Introducció 4

la seva acceptació per part del consumidor. Pels consumidors, la utilització dels subproductes carnis als aliments està relacionada negativament amb la percepció de qualitat. A més, la seva acceptabilitat està determinada per factors molt complexes com els costums, la cultura i la religió.

Taula 1.1: Subproductes d’origen animal i possibles aplicacions.

1. Menuts o despulles (subproductes comestibles que inclouen òrgans) per a consum humà.

2. Greixos comestibles per a la fabricació de margarines, productes de pastisseria, dolços i xiclets.

3. Ossos provinents de desossat mecànic per fabricar sopes, botons, mànecs de ganivets, farines d’ossos, diferents varietats de ceràmica o utilitzats en el refinat del sucre.

4. Sang per a consum humà o per fabricar farines de sang, adhesius o fertilitzants.

5. Renina per a la fabricació de formatges.

6. Intestins per tripes d’embotits, cordes d’instruments musicals, material de sutures quirúrgiques.

7. Gelatina per a productes de pastisseria, rebosteria i gelateria.

8. Substàncies terapèutiques: hormones, albúmina, bilirrubina, epinefrina, insulina, extractes hepàtics, pepsina, testosterona, tromboplastina, timocrescina i tiroxina.

9. Pinsos compostos (generalment molt rics en proteïnes i substàncies minerals) per a ramaderia, gossos, gats i aqüicultura.

10. Pells i cuirs. Pèls per a brotxes, catifes, aïllaments i equipaments esportius. Plomes per a aïllaments, coixins, articles esportius i pinsos per a animals.

11. Llana i extractes de lanolina.

12. Greixos no comestibles de múltiples usos industrials (fabricació de pneumàtics, lubricants, insecticides i germicides).

13. Fertilitzants i adobs.

Font: American Meat Institute, 1958; Levie, 1976; citat per Ockerman i Hansen (1994). Ockerman i Hansen (1994) descriuen varis requeriments que han de complir els subproductes d’origen animal per poder utilitzar-los: (1) existència d’un procés comercial pràctic per poder convertir el subproducte animal en un article aprofitable per a la indústria; (2) obtenció del subproducte en quantitat suficient en un lloc determinat, de manera que el seu processament sigui econòmic; (3) existència d’un mercat potencial o real pel producte final; (4) existència d’algun procediment tecnològic de conservació adequat que permeti l’emmagatzematge del subproducte abans i després de processarlo; i (5) existència d’operaris especialitzats per treballar en aquest tipus d’indústries. Tanmateix, la dificultat d’assolir aquests requeriments fa que en molts casos la transformació i reutilització d’alguns subproductes no sigui del tot viable.

Capítol 1 5

1.2 La sang de porc

La sang és el medi intern de l’organisme encarregat del transport d’oxigen i nutrients cap als diferents teixits i cèl·lules, i de l’eliminació dels metabolits, i representa al voltant del 3,5 % dels animals vius. Conté substàncies amb activitat biològica que poden contribuir en la neutralització d’agents tòxics, altres de funció immunològica, així com enzims i hormones. La sang està composada principalment per aigua i proteïna. Està formada per una substància intercel·lular, el plasma, i per diferents tipus de cèl·lules en suspensió que formen la fracció cel·lular.

De la sang sencera es poden obtenir diferents fraccions en funció de si se li addicionen substàncies anticoagulants o no (Figura 1.1). El procés de fraccionament de la sang, per separar el plasma de la fracció cel·lular, consisteix en centrifugar la sang sencera, a la qual, prèviament, se li ha addicionat algun agent anticoagulant, essent els més freqüents l’àcid cítric o el citrat sòdic i els polifosfats. Tanmateix, en absència d’anticoagulants, a partir de la sang coagulada, es pot obtenir el sèrum, que és l’equivalent al plasma, però sense la presència del fibrinogen i de precursors dels factors de la coagulació.

grup Hemo globina

sang sencera

sense anticoagulant

sèrum sang coagulada

amb anticoagulant

plasma fracció cel·lular

Hemoglobina estroma

cèl·lules fibrina

Figura 1.1: Diferents fraccions de la sang (Ranken, 1980). La sang és una de les fonts de proteïna més valuosa i infrautilitzada que genera la indústria càrnia (Ledward i Lawrie, 1984). A la Taula 1.2 es presenta la composició de la sang i de les seves fraccions. El plasma sanguini, que representa aproximadament entre el 55 i el 65 % de la sang, està composat principalment per aigua (entre un 90 i un 91 %); la resta es correspon majoritàriament a les proteïnes plasmàtiques: globulines, albúmines i fibrinogen. La fracció cel·lular (entre el 35 i el 45 % de la sang) té un contingut en humitat del 65 % i l’hemoglobina representa el 90-91 % del seu extracte sec total (35 %); Introducció 6

la resta de la proteïna i els lípids formen part de l’estroma dels eritròcits. També cal considerar el contingut en ferro del grup hemo de l’hemoglobina.

Taula 1.2: Composició de les fraccions de la sang (en g·100 g-1).

Component Sang sencera Sèrum

(66% de la sang)

Plasma

(60% de la sang)

Fracció cel·lular

(40% de la sang)

Aigua 80,8 91,2 90,8 60,8

Sals minerals 0,9 0,8 0,8 1,1

Greixos 0,2 0,1 0,1 0,4

Proteïnes: 17,0 7,5 7,9 35,1

Albúmina 2,2 3,3 3,3 -

Fibrinogen 0,3 - 0,4 -

Globulina 2,8 4,2 4,2 -

Estroma 1,7 - - 5,1

Hemoglobina 10,0 - - 30,0

Altres substàncies 1,1 0,4 0,4 2,6

Font: Ranken (1980).

1.3 Revaloració i aprofitament de la sang

Quan els animals d’abast es transformen en la canal a l’escorxador, es generen grans quantitats de sang. Segons la FAO, l’any 2001 es van sacrificar aproximadament uns 36 milions de caps de porcí a l’Estat Espanyol; suposant que el volum de sang que es recull és d’uns 2,5-3 L per porc, es van produir unes 97.000 tones de sang de porc. La sang és un dels subproductes amb més poder contaminant, amb una DBO5 de 250.000 mg·L-1 i una DQO de 375.000 mg·L-1 (Tritt i Schuchardt, 1992) i, per tal de reduir la càrrega orgànica en els efluents dels escorxadors industrials, és essencial recuperar-la. A la Taula 1.3 es citen les possibles aplicacions o vies d’aprofitament de la sang en diferents sectors industrials, per exemple: com additiu en productes alimentaris, alimentació animal, laboratoris, usos mèdics i farmacològics, com a primera matèria en algunes indústries i com a fertilitzant.

Fins fa poc, la major part de la sang produïda als escorxadors de l’Estat espanyol s’ha estat utilitzant com a suplement proteic en la fabricació de pinsos compostos en forma de farines de sang. Tanmateix, des de l’any 2000, arran dels problemes sanitaris d’encefalopatia espongiforme bovina (EEB o BSE), han aparegut noves reglamentacions sanitàries pels pinsos que contenen proteïnes d’origen animal. L’Ordre APA/1556/2002, Capítol 1 7

del 21 de juny (BOE número 151, del 25 de juny de 2002), estableix el sistema de control per assegurar la correcta eliminació i la traçabilitat de la destinació dels subproductes generats a la indústria càrnia, com a mesura de protecció contra les encefalopaties espongiformes. Com a conseqüència, actualment, i fins que no aparegui una nova reglamentació menys restrictiva, existeix una prohibició temporal de l’ús de proteïnes animals elaborades al territori de la Unió Europea per a l’alimentació d’animals de producció; els subproductes i les despulles generats en la cadena alimentària càrnia s’han de tractar com a residus especials, s’han de retirar i sotmetre a tractaments de destrucció, i els materials especificats de risc (MER) s’han d’excloure de la cadena alimentària. En aquest context, sembla que algunes de les possibles aplicacions de la sang estan actualment limitades, però hem de considerar que la sang està considerada com un producte de baix risc, com la llet i la carn. Per tant, està totalment justificat el fet de trobar alternatives viables que permetin la seva revaloració, sempre i quan es puguin obtenir productes finals amb bones característiques higienico-sanitàries.

Taula 1.3: Aplicacions de la sang.

Aliments Agent emulsionant, estabilitzant, gelificant, clarificant, colorant, component nutricional, substitut de la clara d’ou.

Pinsos compostos Suplement de lisina, estabilitzador de vitamines, substitut de la llet, component nutricional.

Fertilitzants Revestiment de llavors, estabilitzant del pH del sòl, components minerals.

Laboratoris Medis de cultiu, peptones, albúmines, globulines, esfingomielina, catalasa.

Medicina Proves bioquímiques d’aglutinació, immunoglobulines, tècniques de fraccionament, factors de coagulació, material de sutures quirúrgiques, fibrinogen, derivats de fibrina, serotonina, plasminogen, additius del plasma.

Altres sectors Adhesius, finalitzadors pel cuir i teixits, coadjuvants d’insecticides, extintors per a incendis, fabricació de ceràmica i plàstics, formulacions base de plàstics i cosmètics.

Font : De Divakaran (1980; citat per Ockerman i Hansen, 1994). Des de l’any 1982 existeix una empresa (APC Europe) a la comarca del Vallès Oriental que gestiona la recollida, tractament i aprofitament de la sang procedent d’escorxadors de Catalunya i d’alguns de l’Estat espanyol. Han desenvolupat l’obtenció i comercialització de varis productes a partir de la sang que tenen aplicacions en el sector alimentari, cosmètic, farmacològic, dietètic i agrícola. El principal problema que comporta la utilització de la sang per a l’alimentació humana és l’elevada contaminació microbiològica que aquesta presenta. La sang a l’interior dels Introducció 8

animals sans és estèril, però durant el procés de sacrifici i dessagnat es sol barrejar amb l’aigua de rentat que regalima per l’animal i amb la brutícia de l’exterior de la pell pròxima a la zona del tall de dessagnat. Aquest fet provoca un augment considerable de la càrrega microbiològica, arribant a una contaminació de l’ordre de 106 ufc·mL-1 de microorganismes aerobis mesòfils viables (Gill, 1988; Parés, 1995), i condiciona negativament la seva possible utilització com a primera matèria de la indústria alimentària.

1.3.1 Sistemes de recollida de la sang a l’escorxador

Un dels principals factors que influencien el grau de contaminació microbiològica de la sang obtinguda a l’escorxador és el sistema de recollida utilitzat. En funció del procediment utilitzat es poden diferenciar dos tipus de sang de diferent qualitat: la sang veterinària i la sang higiènica (Rodríguez, 1994).

1.3.1.1 Sang veterinària

És la sang obtinguda mitjançant el dessagnat normal amb ganivet, recollida en banyeres on es sol barrejar amb substàncies estranyes (orins, aigües de rentat, excrements, etc.) que presenten una elevada càrrega microbiològica contaminant i, per tant, fa que aquesta no es pugui utilitzar com a primera matèria per a l’alimentació humana. La sang recollida per aquest mètode (sistema obert), també anomenada sang zootècnica, és la que fins a l’aparició de les restriccions per a l’ús dels subproductes d’origen animal s’havia estat destinant a l’elaboració de pinsos compostos per a l’alimentació animal en forma de farines de sang, però ara és recollida per empreses autoritzades per a la seva destrucció.

1.3.1.2 Sang higiènica

És la sang recollida directament del flux sanguini de l’animal, amb la qual es pot obtenir una sang neta, exempta de qualsevol altre producte i amb una càrrega microbiològica molt baixa, teòricament de l’ordre de 10 ufc·mL-1 (Gill, 1988), però a la pràctica tampoc és així. D’aquesta manera s’aconsegueix un producte amb un valor afegit superior. Aquest tipus de recollida es fa amb un ganivet tubular de fulla balmada o trocar, del qual surt un tub que va directament, o passant per un bescanviador de calor, cap a un dipòsit refrigerat (Figura 1.2). Addicionalment, aquest ganivet pot estar provist d’un dispositiu que permet afegir l’anticoagulant durant el procés de recollida de forma simultània (Wismer- Pedersen, 1988). Capítol 1 9

Figura 1.2: Sistema de recollida higiènica de la sang d’escorxador (Wismer- Pedersen, 1988) i detall del ganivet utilitzat (Ockerman i Hansen, 1994).

Tot i que el producte final recollit amb el sistema higiènic o tancat té un valor afegit molt més gran que el de la sang recollida de forma convencional pel sistema obert, i una qualitat microbiològica i unes característiques físico-químiques aptes per a la seva utilització en alimentació humana, no existeixen gaires escorxadors que utilitzin aquest mètode. Aquest sistema s’utilitza principalment en escorxadors de boví dels Estats Units. El principal problema de la utilització de ganivet balmat és que el procés de dessagnat és més lent i fa disminuir la velocitat de la línia de sacrifici, fet que provoca una disminució del rendiment del procés, especialment en el cas del porcí, on el volum de sang que es recull és molt inferior al de la línia de boví. Aquest sistema presenta altres inconvenients, com les possibles pèrdues d'algunes parts de la canal en porcí, donat que el ganivet pot malmetre l’espatlla de l’animal, i que, a la pràctica, la qualitat microbiològica obtinguda tampoc és la teòrica.

Per aquests motius, a l’estat espanyol molts escorxadors apliquen un sistema de recollida obert modificat, que consisteix en prendre una sèrie de mesures higièniques com són: desinfectar periòdicament la zona de dessagnat, addicionar immediatament l’anticoagulant, refrigerar ràpidament la sang i emmagatzemar-la en condicions de refrigeració fins al moment de la recollida. Introducció 10

1.3.2 Valor nutritiu de la sang

La sang és un producte amb un valor nutricional semblant al de la carn magra, amb un elevat contingut en proteïnes, al voltant del 15 % que, a més, tenen un valor biològic considerable. El valor biològic (BV) d’una proteïna és un paràmetre que permet avaluar la qualitat de les proteïnes alimentàries, i es defineix com la fracció de nitrogen retingut en l’organisme pe al creixement i el manteniment de la síntesi cel·lular (Robinson, 1991). Les proteïnes de la sang presenten tots els aminoàcids essencials per a la nutrició humana (Tybor et al., 1975). Un aminoàcid o qualsevol altre component de la dieta és essencial per a l’home i els animals, en primer lloc, quan aquests no el poden sintetitzar i, en segon lloc, quan és necessari com a component de la dieta, per si mateix o per un dels seus derivats metabòlics, per dur a terme les funcions metabòliques i el creixement normal. La sang sencera és una font important de ferro i de lisina. Conté aproximadament uns 30 mg·100 g-1 de ferro, mentre que la carn de vedella o la de porc en presenten 2,6 i 1,6 mg·100 g-1, respectivament (Gorbatov, 1988). L’alt contingut en lisina fa que la sang o les seves proteïnes siguin un excel·lent complement per augmentar el valor biològic dels productes fabricats a partir dels cereals, els quals són deficitaris en aquest aminoàcid (Young et al., 1973; citat per Satterlee, 1975). L’addició de tan sols un 2 % de proteïnes del plasma en pols al pa, augmenta un 15 % el seu contingut en proteïna i aproximadament un 75 % de lisina en relació a les quantitats d’aquests compostos abans de l’addició (Ockerman i Hansen, 1994). Cal destacar, però, que la sang és deficient en els aminoàcids essencials isoleucina i metionina (presents en elevada quantitat a les carns vermelles), fet que no ha de suposar una limitació, doncs aquesta sang normalment s’afegirà a altres productes alimentaris com a suplement proteic o per la seva funcionalitat.

1.3.3 Propietats funcionals de la sang

Les propietats funcionals dels components dels aliments són totes aquelles propietats no nutricionals que influencien la utilització d’un ingredient en un producte alimentari. La major part de les propietats funcionals tenen influència sobre les característiques organolèptiques de l’aliment, especialment la textura, però també determinen el comportament físic dels aliments o dels ingredients durant el processat, emmagatzematge i preparació i, per tant, afecten a la qualitat i l’acceptabilitat dels aliments (Pomeranz, 1991). Les propietats funcionals de les proteïnes són propietats físico-químiques, dependents de l’estructura primària, secundària, terciària i quaternària, i es poden classificar en tres grans grups: les propietats d’hidratació (interaccions proteïnaaigua), com l’absorció, capacitat de retenció d’aigua, inflament, dispersabilitat, solubilitat i viscositat; les propietats dependents de les interaccions proteïna-proteïna, com la precipitació i la gelificació; i les propietats de superfície, entre les quals cal destacar les Capítol 1 11 capacitats escumant i emulsionant (Cheftel et al., 1989). A la Taula 1.4 es poden veure les principals propietats funcionals de les proteïnes de la sang. Aquestes propietats funcionals determinaran les possibles aplicacions de les proteïnes de la sang. El plasma es pot utilitzar en productes que consisteixen en, o contenen, elements en un sistema gelificat per la calor (com per exemple salsitxes); per contra, la globina, que presenta una molt bona capacitat d’inflament amb l’aigua, es pot utilitzar en sistemes fluids i viscosos que han de romandre fluids després de l’escalfament o per les seves propietats escumants i emulsionants (Ranken, 1980).

Taula 1.4: Propietats funcionals de les proteïnes de les fraccions la sang.

Propietat funcional Proteïnes del Plasma Globina

Solubilitat bona bona a pH inferior a 6

Inflament amb aigua pobre molt bona

Viscositat baixa mitjana

(alta després de l’escalfament)

Capacitat emulsionant mitjana bona

Estabilitat de l’emulsió bona (menor en presència de sal) bona a pH inferior a 6 (millor en presència de sal)

Capacitat escumant bona molt bona

Formació de gels molt bona a Tª ³ 70ºC, la força del gel incrementa amb l’addició de sal

no forma gels, forma una crema

o pasta espessa

Font : Ranken (1980).

1.4 Fracció plasmàtica

La fracció plasmàtica de la sang és un líquid amb un 7-8 % de proteïnes d’alt valor nutritiu: albúmines, globulines i fibrinogen. A diferència d’altres fonts de proteïna d’origen animal, el plasma pràcticament no conté colesterol i proporciona un elevat contingut en proteïna càrnia als derivats als quals s’incorpora. Pel que fa a les seves propietats funcionals, cal destacar la capacitat de formar gels per escalfament, la formació d’escuma i una excel·lent capacitat emulsionant. Les propietats gelificants del plasma són semblants a les de la clara de l’ou, fet que el converteix en un possible additiu per millorar la textura i el rendiment de productes carnis, postres i productes de pastisseria i rebosteria. La seroalbúmina i la seroglobulina també són bons agents emulsionants. Si es compara la capacitat emulsionant del plasma amb altres additius, és inferior a la de la Introducció 12

caseïna, però superior a la de la farina de soja i a la de les proteïnes càrnies (Ockerman i Hansen, 1994). S’ha proposat la utilització del plasma com a substitut de la clara de l’ou en productes de pastisseria, donat que les proteïnes plasmàtiques presenten una capacitat escumant comparable a la de l’albúmina d’ou, malgrat que l’estabilitat de l’escuma obtinguda sigui inferior (Parés, 1998).

1.5 Fracció cel·lular

A la Taula 1.5 es pot observar la composició química de la fracció cel·lular de la sang de porc. La fracció cel·lular o corpuscular de la sang està composada principalment pels eritròcits o cèl·lules vermelles (Figura 1.3), que tenen una forma de disc bicòncau i que són els responsables del transport dels gasos (oxigen i diòxid de carboni) i, en menor proporció, pels leucòcits (cèl·lules blanques) i els trombòcits (plaquetes) que intervenen en els fenòmens de la coagulació.

Taula 1.5: Composició química de la fracció cel·lular de la sang de porc.

Components (g·100g-1 de sang de porc)

Aigua 62,56

Sòlids totals 37,44

Hemoglobina 32,68

Altres proteïnes 1,92

Sucres --

Colesterol 0,049

Lecitina 0,346

Greix --

Àcids grassos 0,006

Fòsfor als àcids nucleics 0,010

Sodi --

Potassi 0,496

Òxid fèrric 0,159

Calci --

Magnesi 0,015

Clor 0,147

Fòsfor total 0,206

Fòsfor inorgànic 0,165

Font: Adaptat de Gorbatov (1988).

Els eritròcits contenen majoritàriament l’hemoglobina (Hb), que és la proteïna més abundant de la sang, ja que representa entre un 60 i 70 % de la proteïna total de la sang sencera (del 11 al 17 %) i pràcticament la totalitat (quasi el 90 %) del contingut en Capítol 1 13 proteïna que conté la fracció cel·lular (del 35 al 38 %). La fracció cel·lular es pot sotmetre a un tractament d’hemòlisi per trencar els eritròcits i, d’aquesta manera, es pot recuperar l’Hb en forma de concentrat i, per centrifugació, es pot separar l’estroma (paret cel·lular), que consisteix en una matriu semblant a una esponja composada fonamentalment per lipoproteïnes.

Figura 1.3: Fotografia SEM dels eritròcits de la

fracció cel·lular de la sang (Sullivan, J.A.®, a:

http://www.cellsalive.com).

1.5.1 L’hemoglobina

L’hemoglobina (Hb), proteïna responsable del color vermell de la sang, és una macromolècula d’estructura complexa amb un pes molecular de 68.000 Daltons. L'Hb dels vertebrats està formada per quatre subunitats polipeptídiques: dues cadenes alfa i dues beta (a2 b2), disposades de forma esfèrica en l’espai. Cada polipèptid (globina) conté un grup prostètic, el grup hemo, una molècula macrocíclica anomenada protoporfirina que té un àtom de ferro, localitzat en una espècie de butxaca rica en residus apolars i unit a la part proteica (Figura 1.4).

El grup hemo és el pigment respiratori de la molècula i el responsable de la coloració de l’Hb, que depèn únicament i directa de l’estat d’oxidació d’aquest pigment. El grup hemo consta d’una part orgànica i un àtom de ferro. La part orgànica, la protoforfirina, està formada per quatre grups pirròlics units entre si en forma d’anell. L’àtom de ferro està lligat a 5 àtoms de nitrogen, dels quals 4 pertanyen al centre de l’anell porfirínic, i el cinquè a la histidina F8 de la globina; el sisè enllaç de coordinació queda disponible i pot fixar molècules com O2, CO2 i H+, mentre que el ferro roman bivalent (Fe2+). El ferro hemínic pot estar en estat d’oxidació ferrós (Fe+2) o fèrric (Fe+3) i les formes corresponents de l’Hb s’anomenen ferroHb (Hb-Fe2+) i ferriHb (Hb-Fe3+), respectivament (Figura 1.5). La ferriHb també s’anomena metaHb. Només la ferroHb pot captar oxigen (Stryer, 1995).

Hb-Fe2+ oxigenació (O2) O2 Hb-Fe2+

ferrohemoglobina oxihemoglobina

porpra vermell intens

Hb-Fe3+

metahemoglobina

1.5.2 Valor nutritiu de l’hemoglobina i la globina

El contingut en aminoàcids essencials de l’Hb i la globina es mostra a la Taula 1.6. Les variacions entre les diferents globines es deuen al tipus de metodologia utilitzada per al seu aïllament. Tant l’Hb com la globina són excel·lents fonts de leucina i lisina. El contingut en altres aminoàcids essencials (fenilalanina, triptòfan, treonina i valina) supera els requeriments proposats per la FAO. Però, com ja s’ha exposat anteriorment en el cas de la sang, els aminoàcids limitants són la metionina i la isoleucina. Malgrat això, com que s’utilitzarà per augmentar el valor nutritiu de productes que ja contenen proteïna, o per les seves propietats funcionals, aquesta deficiència no suposa cap inconvenient.

Taula 1.6: Composició en aminoàcids essencials de l’hemoglobina i la globina, obtinguda per

diferents mètodes (g·100 g-1) (Wismer-Pedersen, 1988).

Aminoàcid Hemoglobina Globina a Globina b Globina c

Requeriments

humans (FAO)

Nens Adults

Isoleucina 0,58 0,33 0,17 0,44 3,7 1,8

Leucina 13,36 11,40 13,3 13,78 5,6 2,5

Lisina 8,26 6,85 8,2 8,94 7,5 2,2

Metionina 0,92 0,76 1,4 0,76 -d -

Cistina 0,73 0,61 0,5 0,64 - -

Aminoàcids

amb S totals

1,65

1,37

1,9

1,40

3,4

2,4

Fenilalanina 6,49 5,77 5,4 6,79 3,4 2,5

Tirosina 2,21 1,70 2,3 1,48 3,4 2,5

Treonina 3,15 2,43 5,4 3,00 4,4 1,3

Triptòfan 1,90 1,60 ND 0,90 0,5 0,7

Valina 8,82 6,94 8,7 10,24 4,1 1,8

a Globina aïllada amb acetona segons Kuppevelt et al. (1976).

b Globina aïllada amb carboximetilcel·lulosa (CMC) segons Sato et al. (1981).

c Globina segons Wismer-Pedersen (1987).

d no establert.

ND: no determinat.

1.5.3 Propietats funcionals de l’hemoglobina i la globina

L’Hb és una proteïna de gran solubilitat i presenta una elevada activitat emulsionant (Nakamura et al., 1984) i capacitat de desenvolupar escumes estables (Wismer- Pedersen, 1988). La capacitat escumant de la globina i l’estabilitat de l’escuma és major que la del plasma (Tybor et al., 1975) i relativament estable enfront les variacions de pH i la concentració de sal. Sense el grup hemo, la globina és menys resistent que l’Hb a la Introducció 16 calor i als agents desnaturalitzants, com els solvents orgànics o el pH àcid utilitzats en els processos de descoloració. La conseqüència més desfavorable és la dràstica disminució de la solubilitat que experimenta la globina a intervals de pH d’entre 6,5 i 9, més accentuada en presència de sal. Aquesta disminució de solubilitat també repercuteix en una menor capacitat escumant i emulsionant.

A diferència de les proteïnes del plasma, la globina no forma gels per escalfament, essent una característica molt interessant si es vol utilitzar en productes carnis; però presenta una elevada capacitat d’inflament que confereix una consistència cremosa en el producte quan una dispersió de globina al 10 % s’escalfa a 80ºC. També presenta una gran capacitat de retenció d’aigua, propietat desitjada en molts productes carnis cuits. Una altra possibilitat és la utilització combinada de la globina i el plasma sanguini, ja que en presència d’un 1 % de sal formen un gel més ferm que el plasma sol a pH 5-5,4 (Wismer- Pedersen, 1988).

1.5.4 Utilització de la fracció cel·lular

Tradicionalment la FC s’ha utilitzat en molts països per a l’elaboració de productes típics com botifarres negres, morcilles o pastissos de sang, però només es destina a la producció d’aquests tipus de productes una petita proporció de l’Hb disponible, desaprofitant-ne una gran quantitat. El gran potencial de la fracció cel·lular a la indústria alimentària resideix en el seu elevat contingut en proteïna i en la seva funcionalitat. El principal camp d’utilització de la globina són els productes carnis, però també cal considerar altres aplicacions. A causa del seu elevat contingut en lisina, es pot utilitzar per l’enriquiment de cereals com el blat i el blat de moro. La globina també es pot utilitzar combinada amb el plasma per substituir l’ou en l’elaboració de galetes i d’altres productes de pastisseria (Wismer-Pedersen, 1988). Altres aplicacions possibles es troben en el camp de l’alimentació humana, com a font de ferro i aminoàcids essencials i en la nutrició animal, on diversos autors han suggerit l’obtenció d’hidrolitzats proteics a partir de l’Hb. També es pot utilitzar en petites quantitats per millorar el color d’alguns productes carnis. Ranken (1980) cita la conversió de l’Hb a nitrosil Hb i a carbonil Hb, compostos que es poden utilitzar per proporcionar coloració vermella en múltiples aplicacions, sobretot en embotits, donat que la nitrosil mioglobina és el pigment responsable del color dels productes carnis curats com el pernil. Aquesta possibilitat és molt interessant en aquells països en els quals no estan permesos els colorants vermells artificials. Quant al pigment hemo, obtingut com a residu en la hidròlisi de l’Hb, ja hem descrit que es pot aprofitar com a colorant alimentari d’origen carni, però d’aquest es pot recuperar el ferro hèmic, el qual pot tenir molt bones aplicacions farmacològiques en el tractament de Capítol 1 17 l’anèmia, doncs segons Rodríguez (1994) i Wismer-Pedersen (1988) aquest s’absorbeix més fàcilment, fins i tot de dos a tres vegades més, que quan es dóna en forma de sals de ferro o de ferro lliure.

1.6 Objectius generals i estructuració del treball

Els objectius generals del treball que es presenta fan referència a les diferents possibilitats de revaloració i aprofitament de la fracció cel·lular provinent de la sang de porc d’escorxadors industrials. El treball s’ha estructurat en 4 capítols que tenen diversos objectius concrets.

El Capítol 2 està basat en l’aplicació del procés de deshidratació per atomització com a una tecnologia viable per conservar la fracció cel·lular. Els objectius concrets d’aquesta part del treball són, en primer lloc, determinar les condicions òptimes d’aplicació del procés de deshidratació a la fracció cel·lular; en segon lloc, caracteritzar el producte en pols obtingut des del punt de vista físico-químic i microbiològic, i, finalment, determinar l’activitat de l’aigua (aw) i les isotermes de sorció de la fracció cel·lular deshidratada per tenir informació sobre les possibilitats de conservació del producte durant el període d’emmagatzematge.

Al Capítol 3 s’estudiaran les possibilitats d’evitar l’enfosquiment oxidatiu que pateix la fracció cel·lular durant la deshidratació per atomització en el cas que aquesta es vulgui utilitzar com a un agent colorant d’origen natural i alhora com a ingredient nutricional i/o funcional en productes alimentaris, ja sigui com a una font important de proteïna amb bones propietats funcionals i/o un suplement de ferro orgànic. S’estudiarà si l’addició de diferents substàncies antioxidants i/o segrestants del ferro tenen un efecte protector i estabilitzant del color de l’hemoglobina durant la seva deshidratació i el posterior emmagatzematge.

Els objectius del Capítol 4 són estudiar la viabilitat de l’aplicació de les altes pressions hidrostàtiques com a una tecnologia no tèrmica per higienitzar la fracció cel·lular prèviament al procés d’assecament i així disminuir l’elevada contaminació microbiològica que aquesta presenta. Es determinaran les millors condicions d’aplicació del tractament amb altes pressions a la fracció cel·lular, basant-nos en els seus efectes sobre la microbiota contaminant i sobre algunes característiques funcionals. Un cop fixades les millors condicions de pressurització, s’estudiaran les diferents propietats funcionals de la fracció cel·lular tractada per alta pressió hidrostàtica i deshidratada per atomització. Els objectius del Capítol 5 són l’obtenció d’hidrolitzats proteics descolorats a partir de la fracció cel·lular, amb la finalitat que es pugui addicionar a productes alimentaris com a Introducció 18

ingredient nutricional i/o funcional, sense que proporcioni coloració vermella-marronosa o fosca als productes als quals s’incorpori. S’assajaran diferents enzims proteolítics i s’avaluarà la seva eficàcia en l’obtenció d’hidrolitzats descolorats. També s’estudiaran els efectes de l’aplicació del tractament amb altes pressions hidrostàtiques sobre el procés d’obtenció d’hidrolitzats proteics de la FC. Finalment, es determinaran les condicions de deshidratació per atomització de l’hidrolitzat descolorat d’Hb i les característiques físicoquímiques, microbiològiques i les propietats funcionals dels hidrolitzats proteics d’Hb deshidratats per atomització.

Capítol 2 21

Capítol 2: Conservació de la fracció cel· lular mitjançant la deshidratació per atomització i caracterització del producte en pols.

2.1 INTRODUCCIÓ

El mètode de conservació d’elecció per aplicar a un determinat producte serà aquell procediment que sigui viable tant econòmicament com tècnica, és a dir, dependrà del tipus de producte a conservar, de la seva naturalesa i del valor afegit que se’n derivarà després del seu processament industrial. La sang, i en especial la fracció cel·lular, és un medi idoni per al desenvolupament dels microorganismes ja que té una composició molt diversa i una activitat de l’aigua elevada. Per tant, és important escollir un procés tecnològic de conservació segur des del punt de vista higiènic i sanitari; que garanteixi la seva qualitat (nutritiva, organolèptica i funcional) durant el període d’emmagatzematge, distribució i transport; i econòmic, doncs es tracta d’un subproducte. Martín Yero et al. (1995) fan una revisió dels mètodes de conservació més utilitzats en el tractament de la sang. Els processos que s’apliquen a la sang destinada a l’alimentació animal (sang veterinària) es solen basar en la utilització de conservadors químics, com el bisulfit sòdic, amoníac, àcids clorhídric, fosfòric i sulfúric, o la combinació d’alguns d’aquests. Per a la sang destinada al consum humà (sang higiènica) i/o les seves fraccions, els processos més utilitzats són la refrigeració i la congelació, encara que la deshidratació ocupa un lloc destacat per diversos motius que s’exposaran més endavant. La congelació del plasma es sol fer amb un bescanviador de rodets o de tambors. La superfície dels cilindres està entre -10 i -40 ºC i, després de la congelació, la superfície es rasca amb unes ganivetes i s’obtenen una espècie de flocs. El plasma també es pot congelar amb congeladors de plaques, amb els quals s’obtenen unes peces en forma de blocs. També s’ha suggerit l’addició d’àcid làctic per coagular i conservar la sang, la utilització d’agents antimicrobians com l’àcid sòrbic i el propiònic (Ockerman i Hansen, 1994) i l’addició de bacteris de l’àcid làctic com a cultius bioprotectors per a la conservació de la sang (Morgan, 1985; Pinel, 1985). Al nostre grup s’està portant a terme una altre línia de recerca que té com a objectiu principal desenvolupar un sistema de bioconservació de la sang d’escorxadors industrials amb bacteris làctics (Zamora, 2000). De totes maneres, el sistema més utilitzat per conservar les fraccions de la sang durant períodes llargs de temps és la deshidratació. El plasma, a causa del seu elevat contingut en aigua (90 %), es sol concentrar prèviament a la deshidratació per raons econòmiques. La concentració es sol fer per evaporació, encara que els sistemes de concentració per membranes (ultrafiltració i osmosi inversa) mantenen més intactes les seves Deshidratació per atomització 22

característiques nutritives i funcionals. Després es deshidrata per atomització o en llit fluiditzat, ja que són els processos de deshidratació que produeixen menys modificacions de les propietats funcionals. La fracció cel·lular, amb un contingut en aigua del 65 %, és un producte concentrat i es pot deshidratar sense la necessitat d’una concentració prèvia (Ockerman i Hansen, 1994).

La deshidratació és un mètode de conservació que es basa en la disminució de l’activitat de l’aigua dels aliments, fins a nivells que impedeixen l’activitat microbiològica i que disminueixen al mínim les reaccions químiques i enzimàtiques de deteriorament, sense la necessitat d’utilitzar refrigeració durant el transport i el període d’emmagatzematge (Brennan, 1989). També comporta una disminució de les despeses d’emmagatzematge i distribució a causa de la disminució de pes i volum dels aliments deshidratats. En els processos de deshidratació es produeixen dos fenòmens relacionats entre si, la transferència del calor sensible i del calor latent d’evaporació des del fluid calefactor cap al producte humit, i la transferència de massa, al mobilitzar-se l’aigua en forma de vapor, des de la superfície del producte cap al medi. Entre les capes del producte es creen gradients de temperatura i del contingut en aigua, que tendeixen a equilibrar-se mitjançant la transferència de calor des del medi assecant cap a les zones més fredes, i la migració d’aigua des de la capa més freda cap a la zona més calenta (Martín Yero et al., 1995). La transmissió de calor en un procés de deshidratació es pot produir bàsicament per dos mecanismes: per convecció de l’aire calent, o bé per conducció a través d’una superfície calenta de bescanvi.

La deshidratació per atomització, polvorització o nebulització (spray drying) és un dels processos tecnològics més utilitzats per deshidratar productes líquids. Aquest procediment consisteix en polvoritzar un líquid en forma de petites gotes (esprai) per augmentar la superfície de transferència de calor; quan aquest entra en contacte amb un flux d’aire calent (de 150 a 300ºC), que actua com a fluid calefactor i alhora com a vehiculador, es produeix una deshidratació quasi instantània de les gotes del producte. L’aire calent només cedeix el calor latent de vaporització al producte, mentre que aquest quasi que no augmenta sensiblement de temperatura, amb la qual cosa es minimitza el dany tèrmic sobre els components del producte i, per tant, el valor nutritiu, les característiques organolèptiques i les propietats funcionals dels productes deshidratats per atomització es conserven bastant intactes.

Existeixen diferents tipus d’atomitzadors dissenyats específicament per a cada producte alimentari, però estan destinats a aquells aliments o productes que es puguin atomitzar, és a dir, líquids o fluids de baixa viscositat com la llet, el sèrum de la llet, el cafè, extractes de te, purés i extractes de carn i peix, extractes de llevat, ous líquids, alguns sucs de fruita, colorants i aromatitzants, i proteïnes d'origen animal i vegetal, com per exemple les del plasma o de la fracció cel·lular de la sang. Capítol 2 23

Els components principals d’un deshidratador per atomització són: l’atomitzador pròpiament dit, que nebulitza el producte en forma de gotes petites; una cambra de deshidratació, on es produeix la transferència de calor i de matèria; un dispositiu per a l’escalfament de l’aire; i un sistema de ventilació que permeti la circulació de l’aire i el transport de la pols des de l’entrada de la cambra cap al recipient de recollida. Les partícules deshidratades, suspeses en el flux d’aire, es dirigeixen cap a un equip de separació, normalment un cicló-separador, connectat a la sortida de la cambra que, per diferència de densitat, permet separar i recuperar el producte deshidratat en forma de partícules en pols del flux d’aire humit, recollir-les i envasar-les, o sotmetre-les a altres tractaments com la instantaneïtzació, que permet obtenir productes amb una molt bona capacitat de reconstitució o rehidratabilitat (Brennan, 1996), com és el cas de les llets en pols, cacaus i cafès instantanis.

La trajectòria i la velocitat de partícules en pols a través del sistema determinen el temps de deshidratació, que sol ser molt ràpid, generalment entre 1 i 10 segons. Aquesta característica, minimitza la possibilitat de coagulació de les proteïnes i altres modificacions indesitjables produïdes per la calor en els sistemes clàssics de deshidratació, que es tradueixen en una disminució de la solubilitat i del valor nutritiu dels aliments deshidratats (Martín Yero et al., 1995). El grau de deshidratació i el temps necessari per dur a terme el procés depenen de la temperatura de l’aire, del coeficient de transferència de calor i de la superfície de transferència de calor i, per tant, del diàmetre de les gotes (Toledo, 1991).

2.2 OBJECTIUS

El present capítol té com a principals objectius la determinació de les condicions del procés de deshidratació per atomització de la fracció cel·lular de la sang de porc d’escorxador i la caracterització físico-química i microbiològica del concentrat d’hemoglobina en pols obtingut després del tractament tecnològic. Per determinar les condicions del procés de deshidratació per atomització de la fracció cel·lular es planteja estudiar l’efecte de la temperatura de deshidratació sobre el grau de deshidratació assolit i sobre la funcionalitat del producte, determinant el contingut en humitat, la solubilitat proteica i l'estabilitat tèrmica de la proteïna de mostres de fracció cel·lular deshidratades per atomització a diferents temperatures. Pel que fa a la caracterització físico-química i microbiològica, els objectius són: conèixer la composició química del producte final; avaluar les seves característiques físiques i bioquímiques, així com la seva qualitat microbiològica, ambdós importants paràmetres a Deshidratació per atomització 24  tenir en compte si es vol utilitzar la fracció cel·lular en pols com a ingredient en productes alimentaris; i, finalment, determinar les isotermes de sorció del producte en pols.

a) Per a la caracterització microbiològica de la fracció cel·lular s’han plantejat dos objectius concrets:

§ Estudiar si el tractament d’hemòlisi de la fracció cel·lular amb ultrasons i la posterior centrifugació produeix una disminució de la contaminació microbiològica de la sang.

§ Determinar la contaminació general i investigar la presència d’algunes espècies de microorganismes específics a la fracció cel·lular hemolitzada i a la fracció cel·lular en pols, per observar si el tractament de deshidratació té un efecte de disminució de la càrrega microbiana.

b) Els objectius de la caracterització físico-química de la fracció cel·lular en pols són:

§ Determinar la composició química de la fracció cel·lular deshidratada per atomització.

§ Mesurar i caracteritzar de forma objectiva el color de la fracció cel·lular després de la deshidratació.

c) Determinar les isotermes de sorció de la fracció cel·lular en pols i ajustar les dades de sorció obtingudes de forma experimental a un model matemàtic per conèixer la relació entre el contingut en aigua i l’activitat de l’aigua del producte, de manera que ens permeti obtenir informació sobre l’estabilitat microbiològica i bioquímica del producte deshidratat durant el període d’emmagatzematge.

2.3 MATERIAL I MÈTODES

2.3.1 Disseny experimental

Per dur a terme els objectius exposats del present capítol es varen realitzar una sèrie d’experiments que es resumeixen a continuació:

a) Obtenció de la fracció cel·lular hemolitzada

Es van recollir deu mostres de sang de porc que, després de la centrifugació per obtenir la fracció cel·lular (FC), es van dividir en cinc alíquotes, cadascuna de les quals es va hemolitzar prèviament a la seva deshidratació per atomització. Per escollir el sistema que utilitzaríem per hemolitzar la FC es van realitzar uns assaigs previs per determinar Capítol 2 25 l’eficàcia de la fragmentació mecànica i del tractament mitjançant ultrasons, observant el grau d’hemòlisi assolit en les mostres de FC fresca al microscopi després de cada tractament.

b) Determinació de les condicions del procés tecnològic de deshidratació per atomització

Per establir les condicions més adequades d’operació pel procés de deshidratació del concentrat d’hemoglobina (FC hemolitzada) per atomització es varen dur a terme dos tipus d’experiments:

§ Determinació del cabal òptim d’alimentació del producte a la cambra de deshidratació.

§ Investigació dels efectes de la temperatura utilitzada en el tractament tecnològic sobre les característiques físico-químiques i funcionals del producte final. Les deu mostres diferents de FC hemolitzades es van deshidratar per atomització amb diferents temperatures de l’aire i, posteriorment, es varen analitzar el grau de deshidratació assolit, el manteniment de la solubilitat proteica i l’estabilitat tèrmica del producte en pols obtingut.

c) Caracterització microbiològica de la fracció cel·lular

Es varen dur a terme dos tipus d’assaigs microbiològics sobre cadascuna de les deu repeticions de FC:

§ Per una banda, es va estudiar si el tractament amb ultrasons i posterior centrifugació que aplicàvem a la FC fresca produïa una disminució de la contaminació microbiològica general de la primera matèria.

§ L’altre tipus d’assaig fou la determinació de la contaminació general i de la presència d’algunes espècies de microorganismes específics a la primera matèria (la FC hemolitzada abans de la deshidratació) i a la FC en pols, per observar si el tractament de deshidratació per atomització tenia un efecte de disminució de la càrrega microbiana.

d) Caracterització físico-química de la fracció cel·lular hemolitzada deshidratada per atomització

Una vegada descrites les condicions més òptimes d’operació per deshidratar per atomització la FC hemolitzada vàrem determinar la composició química del producte en pols (contingut en humitat, proteïna, greix i sals minerals) i les seves coordenades de color per tal de caracteritzar bioquímicament i física el nostre producte després del procés tecnològic. Aquests estudis es van realitzar sobre deu mostres de FC en pols. Deshidratació per atomització 26

e) Determinació de l’activitat de l’aigua i de les isotermes de sorció de la fracció cel·lular hemolitzada deshidratada per atomització

Per determinar l’activitat de l’aigua i les isotermes de sorció de la FC deshidratada per atomització es van utilitzar tres mostres de FC hemolitzada que havien estat deshidratades per atomització a les condicions d’operació establertes. Les mostres es van escollir a l’atzar i es van identificar com A, B i C.

2.3.2 Procedència de les mostres de sang

Les mostres de sang de porc es varen recollir en un escorxador industrial de la comarca del Gironès. Aquest escorxador utilitza un sistema d'atordiment amb diòxid de carboni i un dessagnat vertical. El sistema de recollida de la sang es tracta d’un sistema obert modificat perquè aplica una sèrie de mesures higièniques després de la seva obtenció. La sang es recull en una pila de sagnat, immediatament se li addiciona una solució anticoagulant de citrat sòdic al 0,4 % (p/v), es refreda ràpidament mitjançant un bescanviador de calor i s'emmagatzema en un dipòsit en refrigeració (5ºC) fins que és recollida diàriament per una empresa especialitzada. Les mostres de sang van ser recollides en ampolles de vidre estèrils. La sang provenia de l'aixeta inferior del dipòsit d'emmagatzematge, i es va rebutjar sempre el primer broll contingut en l'aixeta ja que possiblement estava més contaminat microbiològicament. El transport de la sang fins al laboratori es va fer en bosses isotèrmiques, proveïdes d’acumuladors tèrmics, per tal de no trencar la cadena del fred i evitar el seu possible deteriorament.

2.3.3 Obtenció de la fracció cel·lular hemolitzada en pols

En aquest apartat es descriuen els diferents tractaments que es varen aplicar a la sang de porc provinent de l’escorxador per obtenir la FC hemolitzada i deshidratada per atomització.

2.3.3.1 Obtenció de la fracció cel·lular

La FC es va obtenir per fraccionament de la sang mitjançant centrifugació i posterior decantació de la fracció plasmàtica. Les mostres de sang es van centrifugar a una velocitat de 2530 x g (Sorvall RC-5C Plus, Dupont Co., Newton, Connecticut, U.S.A.) durant 15 minuts i a una temperatura d’entre 5 i 10ºC. Capítol 2 27

2.3.3.2 Hemòlisi de la fracció cel·lular

La FC conté aproximadament un 90 % de la proteïna en forma d'hemoglobina (Hb). Per poder extreure aquesta Hb de l'interior dels eritròcits i aprofitar-la, s’ha de produir un trencament de la membrana cel·lular. Per tant, abans del procés de deshidratació, la FC es sotmetia a un procés d’hemòlisi dels glòbuls vermells. Existeixen diferents mètodes físics i químics per hemolitzar la FC. La lisi de les membranes cel·lulars es pot induir per diferència de pressió osmòtica, per fragmentació mecànica o mitjançant ultrasons. En el nostre cas, l'hemòlisi per diferència de pressió osmòtica es va descartar doncs suposaria una dilució i, en conseqüència, un menor rendiment en el procés de deshidratació, així com un elevat cost energètic. Es varen realitzar una sèrie de proves preliminars per determinar l’eficàcia de la fragmentació mecànica i de l’aplicació dels ultrasons per hemolitzar els eritròcits. La fragmentació mecànica de l’estroma mitjançant un homogeneïtzador de ganivetes Polytron PT 3000 (Kinematica AG, Littau, Suïssa) no produïa una hemòlisi generalitzada, possiblement perquè el sistema no permetia que la totalitat del volum assajat entrés en contacte amb les ganivetes de l’eix agitador.

Hemòlisi de la fracció cel·lular per ultrasonicació

L’aplicació dels ultrasons és un tractament molt utilitzat per lisar cèl·lules, per exemple per extreure enzims intracel·lulars. A les indústries alimentàries els ultrasons s’utilitzen amb diferents finalitats tecnològiques: homogeneïtzació i emulsificació, com a procés de conservació per la seva capacitat de destrucció de microorganismes, desgasificació de líquids, tenderització del teixit carni, millora de les reaccions de polimerització i despolimerització, envelliment de vins i licors i tractaments de neteja, entre d’altres. La sonicació es basa en l’aplicació d’ultrasons, ones vibratòries similars a les ones sonores de freqüència de més de 16 kHertzs. L’aplicació dels ultrasons en un fluid dóna lloc a un fenomen anomenat cavitació. La cavitació és la capacitat que tenen els ultrasons de formar i destruir cavitats en un líquid. Les cavitats, que poden estar buides o contenir gas o vapor al seu interior, es produeixen per variacions de pressió al fluid. Les bombolles van incrementant el seu volum a mida que augmenta la pressió al seu interior, fins a arribar a pressions de vàries mils d’atmosferes (Carlin, 1972). Quan la pressió és suficientment elevada com per produir el colapse i trencament de les bombolles (implosió), es produeixen unes ones de xoc, responsables de la destrucció de la membrana cel·lular. L’efecte de la cavitació està potenciat per un increment de temperatura i de pressió que els ultrasons causen a l’interior de les cèl·lules i que debiliten la seva membrana cel·lular. L’eficàcia d’un tractament amb ultrasons depèn Deshidratació per atomització 28

principalment de paràmetres ambientals, com el pH, la temperatura, la força iònica del medi de suspensió i el temps d’exposició.

Així doncs, després del fraccionament de la sang, es va procedir a induir l’hemòlisi dels eritròcits mitjançant ultrasonicació. L’aparell utilitzat per ultrasonicar la FC va ser una sonda de laboratori LabSonic U (B. Braun-Biotech, S.A., Melsungen, Alemanya). Es varen assajar diferents condicions del tractament, regulant la potència i el temps d’aplicació, per determinar quin d’ells permetia la màxima eficàcia sense que la mostra augmentés sensiblement de temperatura. Les proves es varen realitzar sobre alíquotes de 250 mL de FC, mantenint les mostres en repòs durant intervals d’un minut entre cada tractament i tenint la precaució de realitzar-ho sobre un bany de gel per contrarestar el possible escalfament produït pels ultrasons.

Per determinar l’eficàcia de l’hemòlisi es varen observar les mostres al microscopi després de cada tractament. Les condicions d’ultrasonicació assajades varen ser les següents:

a) Quatre períodes de 2 minuts a 100 W de potència, amb 1 minut de descans entre tractaments.

b) Tres períodes de 2 minuts a 100 W de potència, amb 1 minut de descans.

c) Tres períodes de 2 minuts a 75 W de potència, amb 1 minut de descans.

Els tres tractaments assajats produïen de forma òptima el trencament de la membrana dels eritròcits, però en el segon i especialment en el primer, l’augment de temperatura era sensiblement major, mentre que en el tercer l’escalfament de la mostra era menyspreable. Per aquesta raó, el tractament amb ultrasons de tres períodes de 2 minuts a 75 W de potència, amb 1 minut de descans entre ells, va ser l’escollit com a mètode per a produir l’hemòlisi de la FC de la sang de porc prèviament a la seva deshidratació per atomització. Després de la ultrasonicació, per tal de separar els components de les membranes (estroma) del concentrat d’Hb de l’interior de les cèl·lules lisades, la FC hemolitzada es va centrifugar a una velocitat de 20900 x g, durant 30 minuts i a una temperatura d’entre 15 i 20ºC.

2.3.3.3 Deshidratació per atomització de la fracció cel·lular hemolitzada

La FC hemolitzada es va deshidratar per atomització en un equip de laboratori Spray- Dryer SD-05 (Lab-Plant Ltd., Huddersfield, West Yorkshire, Anglaterra), l’esquema del qual es mostra a la Figura 2.1. El sistema d’atomització o nebulització es tracta d’una tovera a pressió, amb un desbloquejador per evitar que s’obturi l’orifici de sortida de l’injector (de 0,5 mm de diàmetre), en el qual el líquid és injectat a pressió fent-lo passar a través d’un orifici de diàmetre molt petit o estrangulament; la diferència de pressió entre Capítol 2 29 l’exterior i l’interior provoca l’aspersió del líquid en forma de gotes. En aquest equip el flux d’aire calent i l’alimentació del producte es produeixen en la mateixa direcció i l’aire s’escalfa mitjançant una resistència elèctrica.

Figura 2.1: Esquema de l’equip de deshidratació per atomització (LabPlant Spray Dryer SD-05).

2.2.4 Determinació de les condicions del procés de deshidratació per atomització de la fracció cel·lular hemolitzada

Pel que fa als paràmetres de deshidratació, es varen fixar el flux de l’aire i la pressió del compressor a les condicions màximes que permetia l’equip, essent 64 cm3·h-1 i 2 bars, respectivament, i es van assajar diferents condicions del tractament tecnològic, regulant les variables del procés que tenen una influència més directa sobre el grau de deshidratació, tenint en compte també altres paràmetres de qualitat del producte final. Deshidratació per atomització 30

Es varen fer unes proves preliminars per determinar el cabal òptim d’alimentació del producte, provant a 0,52; 0,9; 1,36 i 1,8 L·h-1, essent el cabal de 0,9 L·h-1 el que permetia la correcta aspersió de la FC i, per tant, l’atomització, obtenint un diàmetre de partícula òptim per a la deshidratació. Amb cabals inferiors s’obtenien partícules en pols de diàmetre massa petit que no es podien recuperar a través del cicló, mentre que cabals superiors no permetien una correcta deshidratació del producte. Un cop fixats el flux de l’aire, la pressió del compressor i el cabal d’alimentació de la bomba es van assajar diferents temperatures de deshidratació per atomització del concentrat d’Hb per optimitzar el procés tecnològic. Les temperatures del flux de l’aire d'entrada utilitzades varen ser: 120, 130, 140, 150 i 160ºC i les de sortida oscil·laven entre 55 a 75ºC, en funció de les d’entrada. A la Figura 2.2 es mostra el diagrama de flux del procediment seguit en aquest estudi per obtenir les diferents mostres de FC en pols. Totes les mostres de FC en pols es van envasar en recipients de plàstic estèrils tancats immediatament després de la seva deshidratació, i es van emmagatzemar a temperatura ambient.

sang de porc + anticoagulant

CENTRIFUGACIÓ

FRACCIÓ CELUL·LAR

plasma

HEMÒLISI PER ULTRASONS

CENTRIFUGACIÓ

concentrat d’HEMOGLOBINA

DESHIDRATACIÓ PER ATOMITZACIÓ

HEMOGLOBINA en pols

ENVASAMENT

2528 x g / 15’ / 5-15ºC

20900 x g / 30’ / 15-20ºC

3 períodes de 2’ a 75 W

1’ descans

inlet 140ºC

outlet 65ºC

Figura 2.2: Diagrama de flux del procés tecnològic d’obtenció de la FC hemolitzada (concentrat d’Hb) deshidratada per atomització.

Capítol 2 31

Per a la determinació de les millors condicions de deshidratació de la FC hemolitzada per atomització, es varen avaluar diferents paràmetres que ens permetien determinar la qualitat final de les mostres en pols i la seva estabilitat durant el període d’emmagatzematge, així com la determinació del grau de desnaturalització proteica produïda pel tractament tecnològic. Es varen avaluar el contingut en humitat i la solubilitat proteica de mostres de FC deshidratades per atomització en diferents condicions de temperatura. També es va dur a terme una anàlisi calorimètrica, amb la tècnica DSC, de la FC fresca i de la FC en pols, per estudiar l’efecte del tractament tecnològic sobre l'estabilitat de l'Hb.

2.2.4.1 Contingut en humitat

El contingut en humitat de la FC fresca hemolitzada i de la FC deshidratada a diferents temperatures es va determinar com el percentatge de pes perdut per dessecació de les mostres a l’estufa a 102 ± 2ºC fins assolir pes constant (ISO R-1442). Totes les determinacions es varen fer com a mínim per duplicat. Es va utilitzar una estufa de dessecació per convecció natural (Selecta) i una balança analítica de 0,1 mg de precisió (Sartorius, model Basic).

2.2.4.2 Solubilitat proteica

La solubilitat proteica de la FC hemolitzada i deshidratada es va determinar mitjançant la tècnica descrita per Morr et al. (1985) que consistia en pesar 0,5 g de FC en pols, amb precisió d’un mg, en un vas de 100 mL i dissoldre-la en 40 mL d’aigua destil·lada mitjançant agitació constant. La solució s’ajustava a pH 7,5. Un cop obtinguda la dispersió completa de la mostra, es deixava en agitació durant una hora amb un agitador magnètic, evitant que es produís vòrtex. La dispersió es transferia a un flascó volumètric de 50 mL i s’enrasava amb aigua destil·lada. La dissolució es centrifugava a 20000 x g durant 30 minuts a temperatura ambient i es recollia el sobrenedant. Finalment, es va determinar el contingut en proteïna del sobrenedant pel mètode Kjeldahl (veure apartat 2.2.6.1). Per calcular el percentatge de solubilitat proteica es va determinar la relació entre el contingut en proteïna del sobrenedant respecte el de proteïna total de la FC (determinat pel mètode Kjeldahl).

2.2.4.3 Anàlisi calorimètrica per DSC

Per obtenir informació sobre el grau de desnaturalització proteica patida durant el procés de deshidratació per atomització, es varen estudiar les propietats tèrmiques de la FC Deshidratació per atomització 32 fresca, la FC en pols i d’un patró d’Hb de sang de porc mitjançant la tècnica DSC (Diferential Scanning Calorimetry). L’anàlisi calorimètrica diferencial ens va permetre comparar les propietats tèrmiques de la FC fresca i/o dels patrons d’Hb de sang de porc amb la FC deshidratada per atomització, així com observar les diferències entre les mostres deshidratades en funció de la temperatura de deshidratació. Aquesta tècnica es basa en la mesura de la diferència d’entrada d’energia entre una substància i un material de referència en funció de la temperatura, mentre la substància i el material de referència estan sotmeses a un programa d’escalfament controlat. L’aparell mesura l’energia necessària per mantenir un balanç nul de temperatura entre la mostra i la referència (Ma et al., 1990). L’anàlisi calorimètrica permet mesurar propietats físiques de diferents substàncies i detectar transicions de primer ordre relacionades amb modificacions de l’estructura nativa de les molècules, com per exemple la desnaturalització proteica o la gelificació del midó. Els tractaments tèrmics indueixen canvis en l’estructura nativa de les proteïnes que poden conduir a una agregació dels polipèptids desnaturalitzats per formar una espècie de coàgul o un gel. El fenomen de desnaturalització tèrmica es pot detectar com un pic endotèrmic als termogrames DSC, doncs el trencament dels ponts d’hidrogen intramoleculars és una reacció endotèrmica. En canvi, l’agregació o el trencament de les interaccions hidrofòbiques són de naturalesa exotèrmica. Per tant, el valor de l’entalpia (DH), calculat a partir de l’àrea del pic endotèrmic de transició, pot donar una estimació de l’energia tèrmica necessària per desnaturalitzar la proteïna. A partir dels termogrames també es pot determinar la temperatura en la qual es produeix la desnaturalització (Td) que es correspon amb la temperatura del pic de transició. Aquests dos paràmetres ens permeten obtenir informació dels efectes dels diferents tractaments tecnològics sobre els components dels aliments (Arntfield et al., 1990). Els estudis dels paràmetres calorimètrics es van realitzar amb un instrument DSC 30 Mettler (Mettler-Toledo, S.A.E., Suïssa) amb nitrogen líquid. Les temperatures i energies es van calibrar mitjançant un patró de zenc, indi i plom, sota les mateixes condicions d’operació que les mostres sotmeses a estudi. Es van assajar alíquotes de 100 mL de mostres de FC fresca, FC en pols (deshidratades per atomització a diferents temperatures) i d'un patró d’Hb de sang porcina (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA), les dues últimes reconstituïdes al 35 % (p/p), contingudes en càpsules d’alumini de 150 mL tancades hermèticament a pressió. Les càpsules de referència contenien un volum d’aigua destil·lada equivalent al contingut en humitat de les mostres (65 mL) amb la finalitat d'obtenir una línia de base recta. Les anàlisis calorimètriques de cada mostra es varen fer com a mínim per triplicat, escalfant des de 30 a 100ºC i amb una velocitat d’escalfament de 3ºC per minut (Parés et al., 1998a). Capítol 2 33 Dels termogrames obtinguts, es va calcular l’àrea del pic de transició endotèrmic, mitjançant integració, utilitzant una línia de base recta, a partir del qual vàrem determinar la variació de l’Entalpia de transició del procés de desnaturalització proteica (DH) en Joules per gram de mostra. També es va obtenir la temperatura de desnaturalització proteica (Td) de les diferents mostres, considerant que es corresponia amb la temperatura en la qual es donava el mínim del pic endotèrmic dels termogrames.

2.2.5 Caracterització microbiològica de la fracció cel·lular

La caracterització microbiològica es va dur a terme sobre 10 mostres diferents de FC fresca, FC hemolitzada per ultrasonicació, i FC hemolitzada i deshidratada per atomització a 140ºC (10 repeticions). Totes les determinacions microbiològiques es varen fer el mateix dia que es recollien i processaven les mostres i es van realitzar en una cabina de flux laminar Telstar BV-100 (Telstar S.A., Terrassa, Barcelona). Per a cadascuna de les mostres, es van fer una sèrie de dilucions decimals que es van creure pertinents per a cada grup o espècie de microorganisme estudiat, tenint en compte també la tècnica utilitzada per sembrar. Aquestes dilucions es van fer amb Aigua de Triptona M.1 (Oxoid Ltd., Basingstoke, Anglaterra).

2.2.5.1 Recompte de microorganismes aerobis mesòfils viables

Es van sembrar, per la tècnica de la sembra en massa, 1 mL de les dilucions pertinents en el medi de cultiu de recompte general no selectiu Base Agar Sang M.2 (Oxoid Ltd., Basingstoke, Anglaterra) liquat i temperat. Les plaques es van incubar en una estufa de cultiu a 31 ± 1ºC durant 48 hores i posteriorment es procedia al recompte de les colònies crescudes en el medi, tant en l’interior com en la superfície.

M.1 : Aigua de Triptona (TW, Oxoid CM 87) composició (g·L-1)

pH: 7,5 ± 0,2 Triptona 10

Clorur sòdic 5

M.2 : Base Agar Sang (BAB, Oxoid CM 55) composició (g·L-1)

pH: 7,3 ± 0,2 Pols “Lab-Lemco” 10,0

Peptona 10,0

Clorur sòdic 5,0

Agar 15,0

Deshidratació per atomització 34

2.2.5.2 Recompte de Staphylococcus aureus

Es va realitzar per la tècnica de sembra en superfície en medi Baird Parker M.3 (Oxoid Ltd.) amb un suplement d’emulsió estèril de Rovell d’ou i Tel·lurit potàssic (Oxoid Ltd.), de 0,1 mL de les dilucions pertinents i es va disseminar amb una nansa de Digralsky estèril. Un cop sembrades les plaques es varen incubar a 37ºC durant 48 h. Finalment es procedia a la lectura de les colònies sospitoses. Les colònies de S. aureus són rodones, convexes, de 2-3 mm de diàmetre, negres, brillants, envoltades d’una zona opaca i han creat un halo transparent de lipòlisi al seu voltant.

2.2.5.3 Recompte de Clostridis sulfit reductors

Amb una pipeta es van inocular en profunditat 1 mL de cada dilució en un tub que contenia 10 mL del medi de cultiu selectiu Agar Sulfit-Polimixina-Sulfadiacina M.4 (Difco Lab., Detroit, USA) i s'afegia aproximadament 1 mL de vaselina estèril per aconseguir condicions d’anaerobiosi. Els tubs es van incubar a 37ºC durant 48 h i el recompte es va realitzar a les 24 i a les 48 h. Les colònies de clostridis s'observen de color negre per la precipitació de sals de sulfur de ferro.

M.3 : Agar Baird Parker (BP, Oxoid CM 275) composició (g·L-1)

pH: 6,8 ± 0,2 Triptona 10,0

Pols “Lab-Lemco” 5,0

Extracte de llevat 1,0

Piruvat sòdic 10,0

Glicina 12,0

Clorur de liti 5,0

Agar 20,0

Addició d’un complement d’emulsió estèril de Rovell d’ou amb Tel·lurit potàssic, al

0,01 % (p/v) de Tel·lurit (Oxoid SR 0554 C).

M.4 : Agar Sulfit-Polimixina-Sulfadiacina

(SPS, Difco 0845-17-0)

composició (g·L-1)

pH: 7,0 ± 0,2 Triptona 15

Extracte de llevat 10

Citrat fèrric 0,5

Sulfit de sodi 0,5

Tioglicolat de sodi 0,1

Tween 80 0,05

Sulfadiacina 0,12

Sulfat de Polimixina B 0,01

Agar 15

Capítol 2 35

2.2.6 Caracterització físico-química de la fracció cel·lular hemolitzada i deshidratada per atomització

2.2.6.1 Composició química de la fracció cel·lular en pols

Les determinacions físico-químiques es varen fer com a mínim per duplicat sobre 10 mostres diferents de FC hemolitzada i deshidratada per atomització a 140ºC, essent aquesta la temperatura escollida per deshidratar el nostre producte en base als resultats obtinguts en la optimització del procés tecnològic.

a) Humitat

El contingut en humitat de la FC deshidratada per atomització es va determinar segons el procediment descrit en l’apartat 2.2.4.1.

b) Proteïna

La determinació del contingut en proteïna total de cada mostra de FC en pols i del sobrenedant per a la determinació de la solubilitat es va realitzar pel mètode Kjeldahl (ISO R-937; A.O.A.C. 65, 1339 (1980)). Es va utilitzar un digestor (Selecta Bloc-Digest) i un destil·lador Kjeldahl automàtic (Selecta Dosi-Gen S-511). Totes les determinacions es varen fer per duplicat. Es va utilitzar un factor de conversió de percentatge de nitrogen a percentatge de proteïna de 6,25.

c) Greix

Per determinar el percentatge de greix es va realitzar l’extracció dels lípids de les mostres, prèviament hidrolitzades i dessecades, en un extractor Soxlhet, utilitzant com a dissolvent orgànic una solució d’èter etílic i èter de petroli (1:1). Posteriorment es procedia a l’eliminació del dissolvent per evaporació i a la determinació del percentatge de greix en cada mostra per gravimetria (ISO-1443; A.O.A.C. 65, 289 (1980)). Es va utilitzar una balança analítica Sartorius de 0,1 mg de precisió.

d) Cendres

El percentatge de sals minerals es va determinar gravimètricament després de la incineració de les mostres, prèviament dessecades a l’estufa a 102 ± 2ºC, en un forn mufla a uns 550ºC durant el temps necessari per assolir un pes constant (ISO R-936). L’elevada presència de ferro a l’Hb era la responsable del color vermellós de les cendres obtingudes. Es va utilitzar una estufa de dessecació per convecció natural (Selecta), un forn mufla (Naber) i una balança analítica de 0,1 mg de precisió (Sartorius). Deshidratació per atomització 36

2.2.6.2 Caracterització dels paràmetres de color de la fracció cel·lular en pols

El color és una característica organolèptica dels aliments molt difícil de caracteritzar doncs es tracta d’una percepció humana, resultat d'una complexa sèrie de respostes fisiològiques i psicològiques a la radiació electromagnètica de longituds d'ona compreses en l'interval de 400 a 700 nm, que dóna lloc a una interpretació subjectiva. Així, per expressar de forma verbal un mateix color, diferents persones donen diferents referències, de manera que resulta molt difícil definir objectivament el color exacte d’un objecte. La determinació del color dels productes alimentaris de forma objectiva es pot dur a terme de forma instrumental, de manera que aquest es pugui mesurar i quantificar. La llum reflexada provinent d'un objecte és un estímul visual i és la que s'utilitza per a realitzar la mesura objectiva del color.

Aquesta llum reflexada es pot dividir en tres components primaris, els quals s’anomenen To (Hue), Lluminositat (Value) i Saturació (Chroma). El To és la longitud d’ona reflexada predominant, que determina que el color percebut sigui vermell, groc, verd, blau, etc.; la Lluminositat o Claredat es refereix a la quantitat de blanc o de negre que té el color, és a dir, si un color és clar o fosc, i permet classificar-lo com a la sensació produïda per algun element de l’escala de grisos; i la Saturació del color o Cromacitat es refereix a la intensitat o força del color, o dit d’una altra manera, el grau en què un color es separa del gris neutre i s’acosta a un color pur de l’espectre. El To i la Saturació conjuntament formen el cromatisme de la sensació del color. Per tant, el color d’un objecte es pot definir com una combinació d’aquests tres elements primaris del color. La Comissió Internacional de la Il·luminació (Comission International de l'Eclairage-CIE) va definir el sistema numèric CIE L* a* b* per expressar de forma més precisa la percepció del color dels objectes. Aquest sistema es basa en l'ús d'observadors i fonts d'il·luminació estàndards i actualment és el més utilitzat per a la descripció exacta del color mitjançant uns paràmetres que fan referència als tres components esmentats. Quan el color s’expressa per aquest sistema, la Lluminositat és “L*“ (100, blanc; 0, negre), el To i la Saturació estan representats per “a*” (vermell, +; verd, -) i “b* ” (groc, +; blau, -) conjuntament. La Saturació o “Croma” (C*) ve descrita per l’equació C* = (a2 + b2)1/2 (Clydesdale, 1984; Guzman et al., 1995). Els tres elements del color (Lluminositat, To i Saturació) es poden visualitzar de forma gràfica en un sistema de tres dimensions (Figura 2.3), on el To es troba a l’exterior, al voltant de l’eix central (formant la “roda dels colors”), i la Lluminositat i la Saturació formen l’eix vertical i l’eix horitzontal des del centre, respectivament. Les coordenades L*a*b* varien en funció del color i es poden representar gràficament per obtenir un diagrama de cromaticitat específic per a cada color, com el que es mostra a la Figura 2.4.

Capítol 2 37

Figura 2.3: Representació tridimensional del sòlid de color segons

l'espai de color CIE L*a*b* (Minolta Co., 1994).

Figura 2.4: Diagrama de Cromaticitat a*, b* que representa la visió

d'un tall horitzontal del sòlid de color a un valor de L* constant

(Minolta Co., 1994).

Deshidratació per atomització 38

En aquest estudi es van caracteritzar els paràmetres de color de 10 mostres de FC hemolitzada que havien estat deshidratades per atomització a 140ºC. La determinació de les coordenades cromàtiques es va fer mitjançant el sistema CIE L*a*b*, amb un colorímetre Minolta CR-300 (Minolta Co., Ltd., Osaka, Japó) calibrat mitjançant la placa de referència estandarditzada corresponent al blanc. Aquest colorímetre utilitza un sistema d’il·luminació difusa, una geometria d’observació amb un angle de visió de 0º, un observador estàndard a 2º i presenta una àrea de mesura de 8 mm de diàmetre, de manera que només la llum reflexada perpendicularment sobre la superfície de l’objecte és recollida pel cable òptic per realitzar les anàlisis del color. Les mesures de color es van dur a terme utilitzant l’il·luminant universal estàndard D65 (corresponent a la llum diürna i que inclou la regió ultraviolada de la longitud d’ona). Es va utilitzar un conus de projecció de vidre (Minolta Co., Ltd., Osaka, Japó) dissenyat per adaptar el capçal de mesura del colorímetre a productes en pols o particulats. Sobre cada mostra de FC en pols es varen realitzar com a mínim tres lectures dels paràmetres L* , a* i b*, girant cada mostra uns 90º entre lectures.

2.2.7 Activitat de l’aigua i isotermes de sorció de la fracció cel·lular hemolitzada i deshidratada per atomització

2.2.7.1 Determinació de l’activitat de l’aigua

La determinació de l'activitat d'aigua (aw) de la FC en pols es va realitzar pel mètode de la interpolació gràfica, basat en la determinació del contingut en humitat de la mostra després que aquesta assoleixi l’equilibri amb una atmosfera d’humitat relativa coneguda. El mètode de la interpolació gràfica és una tècnica gravimètrica que es fonamenta en la detecció de l’augment o la disminució de pes de les mostres d’aliment col·locades en unes cambres estanques, plaques de vidre o recipients tipus twist-off, en els quals es mantenen diferents humitats relatives durant un determinat període de temps i a temperatura constant.

Si es representen les variacions de pes de les mostres en funció de la humitat relativa, l’aw de la mostra es correspon amb el punt de variació de pes nul, és a dir, on la corba obtinguda talla a la recta horitzontal de variació de pes zero i que es correspon a una determinada aw. Amb aquest mètode, si s’utilitzen mostres de diferents humitats, també es poden obtenir les isotermes d’equilibri del producte. Es varen utilitzar tres solucions de sals saturades que proporcionaven una humitat relativa constant a 20ºC (Taula 2.1):

Capítol 2 39

Taula 2.1: Activitats de l’aigua i humitats relatives en l’equilibri a 20ºC de les solucions

saturades de les sals utilitzades en la determinació de l’activitat de l’aigua de la FC en pols.

Sal aw (20ºC) HRE (%)

Acetat potàssic, K(C2H3O2) 0,200 20,0

Clorur magnèsic-6-hidrat, MgCl2 - 6 H2O 0,336 33,6

Nitrat de zenc-6-hidrat, Zn(NO3)2 - 6 H2O 0,420 42,0

Adaptat de Banwart (1982).

Les solucions saturades de les sals van ser introduïdes en recipients de vidre amb tapa twist-off d’uns 450 mL que tancaven hermèticament, obtenint d’aquesta manera un ambient a l’interior del pot amb una humitat relativa constant i característica de cada solució saturada. S’introduïen aproximadament uns 0,5 g de les mostres de FC en pols analitzades, les mostres A, B i C deshidratades per atomització a 140ºC, en gressols de vidre de pes conegut, col·locats sobre uns suports a l'interior dels recipients tal com es mostra a la Figura 2.5.

Figura 2.5: Esquema del dispositiu utilitzat per a la determinació de l’aw i de les isotermes de sorció pel mètode gravimètric. (Font: Busquets, 1996).

Els gressols, prèviament, havien estat condicionats a la humitat relativa corresponent durant 24 h i a 20ºC, per tal de conèixer el seu pes a la corresponent aw. Després de tapar-los hermèticament es varen emmagatzemar a 20ºC durant 7 dies. Passat el temps, les mostres van ser pesades de nou per determinar-ne el percentatge de variació de pes. Cada determinació es va realitzar per duplicat. Es van representar les variacions de pes de les mostres en funció de la humitat relativa, i la determinació de l’aw de cada mostra es feia a partir de la recta de regressió. Per realitzar aquest estudi es va utilitzar un

tapa de rosca

gressol de vidre

solució saturada

recipient de

vidre

fracció cel·lular

en pols

cristalls de sal

suport

Deshidratació per atomització 40

refritherm (Hotcold-M, Selecta) per mantenir les mostres a una temperatura constant de 20ºC, una estufa de dessecació per convecció natural (Selecta) i una balança analítica de 0,1 mg de precisió (Sartorius, model Basic).

2.2.7.2 Determinació experimental de les isotermes de sorció

La determinació de les isotermes de sorció és de gran utilitat per conèixer la relació entre l’activitat de l’aigua i el contingut en aigua dels aliments. La determinació de les isotermes de sorció es va dur a terme experimentalment, mesurant el percentatge d’humitat de la FC deshidratada (g d’aigua per 100 g de matèria seca) després d'estar en un ambient amb una humitat relativa i temperatura constants durant una setmana. Per realitzar aquest estudi es van utilitzar diferents solucions saturades de sals amb una activitat d'aigua coneguda a 20ºC (Taula 2.2) que proporcionaven una atmosfera a l’interior del pot amb una humitat relativa constant. Es van analitzar tres mostres de FC en pols (A, B i C) representatives del producte que havien estat deshidratades per atomització a 140ºC. Per realitzar l'estudi de les isotermes de sorció es va utilitzar el mateix dispositiu que el de la determinació de l'aw que es mostra a la Figura 2.5.

Taula 2.2: Activitats de l’aigua i humitats relatives en l’equilibri a 20ºC de les solucions

saturades de les sals utilitzades per determinar les isotermes de sorció de la FC en pols.

Sal aw (20ºC) HRE (%)

Acetat potàssic, K (C2H3O2) 0,200 20,0

Clorur magnèsic-6-hidrat, MgCl2 - 6 H2O 0,336 33,6

Carbonat potàssic, K2CO3 0,435 43,5

Nitrat magnèsic-6-hidrat, Mg (NO3)2 - 6 H2O 0,549 54,9

Nitrit sòdic, NaNO2 0,656 65,6

Clorur sòdic, NaCl 0,755 75,5

Sulfat de coure-5-hidrat, CuSO4 - 5 H2O 0,980 98,0

Adaptat de Banwart (1982).

Per a la determinació de les isotermes d'adsorció es van col·locar aproximadament uns 0,5 g de les mostres de FC deshidratades per atomització a 140ºC en recipients que contenien solucions saturades que proporcionaven una humitat relativa creixent del 33,6 al 98 % a 20ºC. Passats set dies, es van determinar els continguts en humitat en equilibri de les diferents mostres, per obtenir el comportament del producte quan absorbeix humitat. Per determinar les isotermes de desorció, les mostres de FC en pols es van

Capítol 2 41

mantenir durant una setmana en una humitat relativa constant del 98 %, mitjançant la solució saturada de sulfat de coure. Posteriorment es varen col·locar en ambients amb humitats relatives decreixents, del 75,5 al 20 %, i es va determinar la quantitat d’aigua retinguda per les mostres al cap d'una setmana. Els continguts en humitat en equilibri es van determinar mitjançant dessecació de les mostres a l'estufa a 105ºC fins a pes constant (ISO R-1442). Es va representar gràficament el contingut en humitat en equilibri de les mostres (g d’aigua per 100 g de matèria seca) en funció de cada activitat de l’aigua a 20ºC per a l'adsorció i la desorció. La isoterma d'adsorció es va ajustar a una funció sigmoïdal obtinguda mitjançant regressió no lineal utilitzant el paquet SigmaPlot per a Windows 4.01 (SPSS Inc., 1997).

2.2.7.3 Isoterma d’adsorció de la fracció cel·lular deshidratada per atomització segons el model GAB (Guggenheim-Anderson-De Boer)

S’han proposat diversos models matemàtics que permeten calcular el valor d’alguns paràmetres que donen informació referent a les condicions de màxima estabilitat dels aliments durant la seva conservació. Alhora, aquests models permeten expressar, amb major o menor grau d’aproximació, la relació X = f (aw), per a cada aliment, essent X el contingut en humitat. A efectes pràctics, és important trobar una expressió matemàtica que ajusti els resultats obtinguts experimentalment amb bona precisió. La majoria dels models proposats, ja siguin empírics, semi-empírics o teòrics, poden reproduir les dades de la humitat en equilibri, malgrat que cap d’ells permet donar resultats precisos en tot l’interval d’aw i pels diferents tipus d’aliments. Aquest fet es deu a varies causes, entre les quals podem destacar les següents: · les isotermes d’equilibri representen les propietats higroscòpiques integrades de nombrosos constituents presents a l’aliment, de manera que la disminució de l’aw es deu a una combinació de fenòmens, cadascun dels quals pot predominar en un determinat interval d’aw (Karel, 1973).

· els tractaments tecnològics aplicats als aliments durant la seva elaboració poden modificar i alterar les propietats de sorció dels seus components.

· els aliments, en adsorbir aigua, experimenten canvis en la seva estructura, constitució, etc.

Entre els diferents models teòrics proposats, cal destacar-ne dos dels més utilitzats: el model de Brunauer, Emmett i Teller (BET) i el de Guggenheim, Anderson i De Boer (GAB), ambdós basats en la sorció de la humitat a l’aliment en forma de multicapes.

Deshidratació per atomització 42

A partir de les dades experimentals obtingudes, ajustant els valors d’aw i el percentatge d’humitat (g d’aigua per 100 g d’extracte sec), vàrem determinar la isoterma d’adsorció de la FC en pols segons el model GAB (Castillo et al. 1997; Jouppila i Roos, 1994; Kaminski i Al-Bezweni, 1994; Roos, 1993; Singh i Singh, 1996). Aquesta equació proporciona un ajustament més precís i acurat que el model BET per a un ampli ventall de productes amb diferents continguts en humitat (Jouppila i Roos, 1994; Toledo, 1991). La forma de l’equació utilitzada és la següent:

El model GAB és una equació amb tres paràmetres, on k, CG i Mm són constants; m és el contingut en humitat de la mostra (grams d’aigua per 100 grams de matèria seca); Mm és el contingut en humitat (sobre extracte sec) equivalent a la capa monomolecular d’aigua adsorbida (monocapa); CG és la constant de Guggenheim i k és un tercer paràmetre de correcció de les propietats de les molècules d’aigua de la muticapa respecte al bulb líquid, que millora l’ajustament per a un ampli rang de continguts en humitat. L'estimació de les constants Mm, CG i k del model GAB es va obtenir transformant l’equació 2.1 en la seva forma quadràtica (Caden, 1988). D’aquesta manera, s’obté una equació polinòmica de segon grau com la següent:

2.2.8 Tractament estadístic de les dades

La representació gràfica dels resultats del treball es van dur a terme mitjançant el full de càlcul de Microsoft Excel 97. Els intervals de confiança de les mitjanes es van calcular utilitzant la desviació estàndard de la població (P=95 %). Per realitzar les anàlisis de la variància (ANOVA) es va utilitzar el paquet JMP versió 2.0 (1989-91) del SAS Institute, Inc. per a Machintosh. Es varen considerar com a significatius els valors de probabilitat inferiors a 0,05. Per a la comparació de mitjanes es va aplicar el test de Tukey-Kramer Capítol 2 43 HDS amb un nivell de significació de P=95 %. Les dades que presentaven un valor de P<0,5 a partir del test de Barlett es van transformar. Es van utilitzar les dades logtransformades dels recomptes microbiològics, dels percentatges d’humitat i dels valors de la variació d'entalpia de transició del procés de desnaturalització proteica. Les dades de solubilitat proteica es van transformar segons la expressió: arcsin [(% Solubil./100)1/2].

2.4 RESULTATS I DISCUSSIÓ

2.4.1 Determinació de les condicions del procés de deshidratació per atomització de la fracció cel·lular de la sang de porc

En aquest apartat s’exposen els resultats dels experiments realitzats per estudiar la influència de la temperatura utilitzada per deshidratar per atomització la FC hemolitzada de la sang de porc sobre el contingut en humitat i la funcionalitat de la proteïna, tenint en compte la solubilitat proteica i el grau de desnaturalització produït pel tractament tecnològic, a fi i efecte de determinar les millors condicions de deshidratació per atomització de la FC.

2.4.1.1 Contingut en humitat en funció de la temperatura de deshidratació

La conservació dels productes deshidratats està basada en l’eliminació del 90-95 % de l’aigua que contenen, fet que comporta una disminució de l’activitat de l’aigua (aw). La baixa disponibilitat d’aigua és el paràmetre que determina la bona conservació durant el període d’emmagatzematge a temperatura ambient dels aliments dessecats, ja que limita el desenvolupament dels microorganismes i evita que es produeixin les reaccions enzimàtiques i químiques de deteriorament. A la Figura 2.6 es mostren els percentatges d’humitat de la fracció cel·lular (FC) en pols en funció de la temperatura aplicada en el procés de deshidratació per atomització. Com es pot observar, el grau de deshidratació assolit depèn de la temperatura de l’aire utilitzada durant el procés d’atomització. En augmentar la temperatura de deshidratació, es produeix una disminució del contingut en aigua de la FC en pols, és a dir, incrementa el grau de deshidratació.

S’observa una clara relació inversa entre el contingut en aigua i la temperatura de deshidratació, i a partir dels resultats de l’anàlisi de la variància (ANOVA) es va veure que existien diferències significatives (P<0,05) pel que fa al grau de deshidratació assolit en funció de la temperatura de deshidratació per atomització (dins l’interval de temperatura de 120 a 160ºC). Tanmateix, el test de separació de mitjanes (Tukey-Kramer HSD) ens va permetre separar tres grups significativament diferents, els quals es corresponen a les mostres de FC deshidratades a 120ºC; 140ºC i 160ºC. Entre les deshidratacions realitzades a temperatures d'entre 130 i 150ºC no existeixen diferències significatives, mentre que aquestes temperatures sí que tenien un efecte significativament superior que si es deshidratava a 120ºC i inferior que quan es deshidratava a 160ºC. En general, els aliments deshidratats presenten un contingut en humitat d’entre el 2 i el 10 %, en funció del contingut en aigua inicial i del procediment utilitzat per a deshidratar-los. La FC fresca hemolitzada té un contingut en humitat del 65,9 ± 0,6 % i, després de la deshidratació per atomització, s’obté un producte en pols amb un percentatge d’humitat que va des d’aproximadament el 6,4 %, quan es deshidrata a 120ºC, fins a un 3,9 %, en el cas d’utilitzar una temperatura de l’aire de 160ºC. Aquests valors d’humitat estan per sota del 7 % que recomana Ranken (1980) com a valor màxim per als productes deshidratats de la sang. Així doncs, la tecnologia de deshidratació per atomització és un bon sistema per a conservar el nostre producte, doncs permet eliminar aproximadament el 92 % de l’aigua de constitució de la FC hemolitzada de la sang de porc. A més, aquests percentatges Capítol 2 45 d’humitat del producte en pols es tradueixen en valors d’aw suficientment baixos, entre 0,15 i 0,3 (veure apartat 2.4.3 de les isotermes de sorció), que garanteixen l’estabilitat del producte des del punt de vista bioquímic i microbiològic. Tanmateix, donat que els aliments deshidratats són productes altament higroscòpics, per evitar les possibilitats de rehidratació i assegurar la seva estabilitat durant el període d’emmagatzematge, s’hauran d’utilitzar envasos o recipients estancs i impermeables al vapor d’aigua.

2.4.1.2 Influència de la temperatura de deshidratació sobre la solubilitat proteica

La propietat funcional més interessant de les proteïnes és la solubilitat en aigua o dispersabilitat. Donat que els aliments són sistemes hidratats, el comportament físicoquímic i reològic dels constituents dels aliments depèn de l’estat d’hidratació d’aquests components (Dill i Landmann, 1988). Les propietats d’hidratació de les proteïnes, en concret la solubilitat, són essencials per a l’activitat funcional òptima d’una proteïna en una solució, suspensió o dispersió i, per tant, determinen la utilització o la incorporació d’una proteïna en un producte alimentari. La solubilitat de les proteïnes és molt influent quan es vol impartir “cos” o consistència a solucions aquoses, i en la formació i l’estabilitat d’escumes i emulsions (Pomeranz, 1991). Però, segons Ranken (1980), encara que moltes de les propietats funcionals depenen de la solubilitat, aquest paràmetre no és suficientment precís per descriure el comportament funcional d’una proteïna, doncs la solubilitat pot estar més o menys influenciada pel pH, temperatura, tipus de dissolvent i per la presència d’altres substàncies en el producte, particularment de la concentració de sals. Si estudiem l’efecte d’un tractament tecnològic sobre la solubilitat proteica d’un producte podem conèixer quin efecte produeix aquest tractament sobre les propietats funcionals de les seves proteïnes i, en definitiva, com es veu modificada la funcionalitat global del producte a causa de la desnaturalització proteica. La desnaturalització es defineix com la modificació de l’estructura secundària, terciària i/o quaternària de les molècules proteiques, que no comporta el trencament dels enllaços peptídics covalents implicats en l’estructura primària; per tant, el valor nutritiu no es veu modificat. Aquests canvis en l’estructura proteica sovint estan associats amb canvis de les propietats físico-químiques i funcionals.

És molt freqüent que la desnaturalització proteica produeixi d’un descens en la solubilitat a causa de l’aparició de grups hidròfobs a la molècula, a l’agregació de molècules proteiques desplegades o a un augment de la capacitat d’absorció d’aigua per la proteïna. Cal dir que la determinació del grau d’insolubilització d’una proteïna és, probablement, la mesura més pràctica per estudiar l’efecte d’un procés tecnològic sobre el nivell de desnaturalització o agregació proteica, perquè les proteïnes que es troben en un estat Deshidratació per atomització 46 desnaturalitzat, o parcialment agregat, mostren una disminució de la seva capacitat de gelificació, emulsionant o de formació d’escumes (Cheftel et al., 1989). L’estat “natiu” és el terme que s’utilitza per descriure la conformació tridimensional d’una proteïna en el seu ambient natural o sota condicions similars a les existents a la natura (per exemple: de temperatura, pH, força iònica, etc.); mentre que l’estat “desnaturalitzat” o “desplegat” es refereix a qualsevol desviació significativa de l’estructura nativa que afecta a la funció biològica. Aquesta desnaturalització pot ser reversible o irreversible, depenent de les condicions ambientals i de les interaccions inter i intramoleculars de la molècula proteica desplegada (Dickinson i McClements, 1996). La solubilitat de la majoria de les proteïnes es redueix de forma irreversible durant l’escalfament; fins i tot els tractaments tèrmics més suaus poden provocar cert grau de desnaturalització i insolubilitat. En molts dels processos de conservació dels aliments, s’intenta modificar al mínim la funcionalitat dels seus components. En concret, en la deshidratació per atomització es produeix una dessecació molt ràpida del producte sense que aquest pateixi un increment significatiu de temperatura; es considera que les partícules assoleixen com a màxim la temperatura de sortida de l’aire després de l’atomització i, en el nostre cas, aquesta oscil·la entre 55 i 75ºC, depenent de la temperatura d’entrada de l’aire utilitzada en la deshidratació. A la Figura 2.7 es pot observar la influència de la temperatura utilitzada en la deshidratació per atomització sobre la solubilitat proteica de la FC de la sang. A mesura que augmenta la temperatura, el percentatge de proteïna soluble respecte el percentatge de proteïna total, és a dir, la solubilitat o dispersabilitat de la proteïna de la FC a pH 7,5 (pH de la FC deshidratada reconstituïda), disminueix. Així, les mostres deshidratades a 120ºC tenen un percentatge de solubilitat del 98 %, mentre que en les deshidratades a 160ºC, la solubilitat és aproximadament del 90 %. Aquesta reducció és més acusada de 140 a 150ºC, doncs la solubilitat pateix una disminució del 96 % al 92 %, de manera que a partir de 150ºC la funcionalitat de l’Hb disminueix de forma més intensa. Els resultats de l’ANOVA van mostrar que existien diferències significatives (P<0,05) entre les diferents condicions de temperatura de deshidratació pel que fa a la solubilitat proteica. El test de separació de mitjanes va permetre separar dos grups clarament diferenciats; per una banda, les mostres deshidratades amb temperatures d’entre 120 i 140ºC i, per l’altra, les que s’havien deshidratat a 150 i 160ºC.

Els resultats dels assaigs realitzats per determinar la influència de la temperatura de deshidratació sobre la solubilitat de la FC indiquen que el tractament de deshidratació per atomització no modifica gaire les propietats funcionals de l’Hb, sempre que no es deshidrati a temperatures superiors a 140ºC, doncs la solubilitat es manté bastant intacte; per contra, quan la FC es deshidrata a temperatures superiors a 150ºC la solubilitat del producte en pols és significativament inferior, ja que el tractament tecnològic produeix una desnaturalització més intensa de la proteïna.

També s'ha tenir en compte que l’eliminació de l’aigua produeix una forta agregació proteica en els productes deshidratats perquè es produeixen interaccions proteïnaproteïna, fonamentalment quan s’utilitzen temperatures elevades per aconseguir l’energia necessària per a l’eliminació de l’aigua, fet que pot provocar una disminució significativa de la solubilitat i de les altres propietats funcionals. Aquest efecte però es redueix en els processos de deshidratació per atomització i encara més en la liofilització (Cheftel, 1989).

2.4.1.3 Anàlisi calorimètrica de la fracció cel·lular per DSC

A la Figura 2.8 podem observar els termogrames obtinguts per anàlisi calorimètrica diferencial (DSC) de la FC fresca i de mostres de FC hemolitzades i deshidratades per atomització amb diferents temperatures de l’aire (120, 130, 140, 150 i 160ºC), en els quals es representa el flux de calor (mW) subministrat a la mostra necessari per aconseguir l’equilibri tèrmic entre aquesta i la referència, en funció de la temperatura aplicada.

Si comparem la forma i la magnitud dels termogrames de la FC fresca hemolitzada amb els de la FC deshidratada per atomització a diferents temperatures, es pot observar que els termogrames de la FC fresca hemolitzada presenten un pic endotèrmic doble. El primer, de més magnitud, presenta el mínim a 80ºC mentre que en el pic menor, el mínim s’observa cap als 90ºC. Per contra, en els pics dels termogrames de les diferents mostres de FC deshidratades per atomització no s’observa aquest desdoblament, només presenten un sol pic endotèrmic al voltant dels 75ºC.

Capítol 2 49

Aquestes diferències observades en els termogrames, podrien explicar-se pel fet que el tractament de deshidratació per atomització ha produït la desnaturalització de l’Hb, o que s’han produït algunes modificacions de l’estructura nativa de l’Hb, sense arribar a desnaturalitzar-la completament però que afecten a l'estabilitat tèrmica de la proteïna. Per altra banda, s’ha de tenir en compte que l'estructura quaternària de l'Hb canvia notablement amb l'oxigenació. L'oxihemoglobina (O2 Hb-Fe2+) i la desoxihemoglobina (Hb-Fe2+) difereixen clarament en la seva estructura quaternària: la primera presenta una estructura que s'anomena R (relaxada) mentre que la desoxiHb presenta una estructura T (tensa) a causa de la presència d'enllaços salins (interaccions electrostàtiques) que subjecten el tetràmer. L'oxigenació produeix un moviment de l'àtom de ferro del grup hemo que es tradueix en una alteració estructural en la subunitat; aquest canvi es transmet a les interfases entre les subunitats a i b, ocasionant una ruptura dels enllaços salins intercatenaris de la forma T i aquesta passa a forma R. De fet, la unió de l'O2 al ferro del grup hemo arrossega la histidina proximal de la globina i aquest canvi conformacional es transmet a regions de la molècula molt allunyades (Stryer, 1995). En condicions fisiològiques normals, a la sang coexisteixen les dues formes de l'Hb (oxiHb i desoxiHb). En la FC fresca, com en la sang, també poden coexistir les formes oxiHb i desoxiHb (o ferroHb) i per aquest motiu observem un desdoblament del pic dels termogrames de les mostres de FC fresca: un primer pic de més magnitud i més desplaçat cap a l'esquerra, que es correspondria a la forma desoxiHb, i el segon pic més petit que reflexaria la forma oxigenada. En canvi, a la FC deshidratada, s’observava un sol pic més estret i encara més desplaçat cap a l'esquerra. L'explicació podria ser que la deshidratació per atomització produeix una oxidació del ferro del grup hemo i, per tant, la proteïna es troba majoritàriament en forma de metaHb (o ferriHb), en la qual el ferro està en forma Fe3+ i no es combina amb l'O2. Un altre fet que consolidaria aquesta hipòtesi són els termogrames obtinguts a partir del patró d'Hb de sang de porc, que eren molt petits i apareixien fins i tot molt abans que els de les nostres mostres en pols. Aquest patró es tracta d'Hb dialitzada i liofilitzada i pot ser que la proteïna estigui força oxidada i en conseqüència totalment en forma de metaHb.

L'afinitat de l'Hb per l'O2 està influenciada pel pH; així, a pH àcid l'afinitat per l'O2 disminueix. És per això que als teixits metabòlicament actius com per exemple el múscul, l'elevada concentració de CO2 i d’ions H+ promouen l'alliberació de l'O2 de l'oxiHb als teixits, mentre que a pH bàsic l'Hb té una gran afinitat per l'O2 i aquesta allibera els H+ i el CO2 (als capil·lars dels alvèols pulmonars). Aquest comportament de l'Hb en funció del pH es coneix com l'efecte Bohr (Stryer, 1995). En base a que el pH pot influenciar l'estat de l'Hb, vàrem considerar si la deshidratació per atomització produïa modificacions del pH a la FC i, d'aquesta manera, podríem explicar les diferències observades en l'estudi calorimètric. Deshidratació per atomització 50 En el plasma sanguini, Parés (1998) va observar que la deshidratació conduïa a una alcalinització del producte (des de valors de pH de 7,4 en el plasma líquid fins a valors de pH de 9,2-9,3 en la pols reconstituïda), degut fonamentalment a que l'eliminació de l'aigua comporta la pèrdua de la capacitat tamponant de la sang que proporciona el sistema carbònic-carbonat (CO2 + H2O « H2CO3 « HCO3 - + H+). No obstant, la FC en pols (reconstituïda al mateix extracte sec que la fresca) presenta un pH al voltant de 7,5 ± 0,1, com el de la FC fresca i, en principi, hauríem de descartar aquesta possibilitat. A partir dels termogrames obtinguts per DSC, es van determinar la temperatura de desnaturalització proteica (Td), considerada com la temperatura en la que es produeix el mínim del pic endotèrmic, i la variació d’Entalpia de transició del procés de desnaturalització (DH), calculada a partir de l'àrea sota el pic de transició, que proporciona una estimació de l'energia tèrmica que es requereix per desnaturalitzar la proteïna. Aquests paràmetres calorimètrics permeten distingir les propietats tèrmiques de les diferents mostres estudiades i avaluar l’estabilitat de l’Hb enfront la intensitat del tractament tecnològic d’una forma més objectiva, de forma que, si s'observa una disminució d'aquests paràmetres en les mostres en pols respecte al valor d'aquests abans de la deshidratació, podem treure informació sobre el grau de desnaturalització produït per la deshidratació. A la Taula 2.3 es comparen les temperatures de desnaturalització proteica (Td) i els valors de la variació d’Entalpia de transició del procés de desnaturalització (DH) de mostres de FC en pols deshidratades per atomització a diferents temperatures. També es comparen amb els valors obtinguts en la FC fresca hemolitzada (abans de la deshidratació) i amb els d’un patró comercial d’Hb de sang de porc liofilitzada. El patró comercial d’Hb de sang de porc presenta uns valors de variació d'Entalpia i de temperatura del procés de desnaturalització proteica molt inferiors a les nostres mostres, ja sigui la FC abans de la deshidratació o les mostres en pols. Aquest fet possiblement ve determinat perquè el procediment d’obtenció i purificació d’aquest patró produeix modificacions estructurals en la proteïna nativa i, per tant, determina una desnaturalització més intensa de la proteïna. Això fa descartar la utilització d’aquest patró d’Hb com a referència. Per aquest motiu, es va prendre la FC fresca i hemolitzada com a referència de l’estat natiu de la proteïna abans del tractament tecnològic de deshidratació per atomització.

Si es comparen els valors de la temperatura de desnaturalització i els de la DH, que reflexa la calor absorbida durant la desnaturalització, de les diferents mostres de FC en pols amb els de la FC fresca, es pot observar que el procés de deshidratació per atomització produeix una lleugera desnaturalització de l’Hb. De forma general, s’observa que totes les mostres deshidratades per atomització presenten menor estabilitat tèrmica que les de FC fresca, doncs els valors dels dos paràmetres calorimètrics investigats a les Capítol 2 51 diferents mostres de FC deshidratades per atomització són inferiors que els observats a la mostra fresca. L’ANOVA va demostrar que existien diferències significatives (P<0,05) entre les mostres de FC fresca hemolitzada i les de FC deshidratades pel que fa a la variació de l'Entalpia, així com a la temperatura en la qual es produeix la desnaturalització o el desplegament de l’Hb.

Taula 2.3: Propietats tèrmiques de la FC fresca, de la FC en pols en funció de la temperatura de deshidratació per atomització i d’un patró d’Hb de sang de porc obtingudes per DSC (1). Les determinacions es varen fer a una velocitat d’escalfament de 3ºC·min-1. Les lletres diferents indiquen els grups que són significativament diferents (P<0,05).

mostra Td (ºC) (2) DH (J·g-1) (3)

patró d’hemoglobina 71,10 ± 1,77 1,7 ± 0,41

FC fresca 79,86 ± 0,16 a (pic 1) 90,12 ± 1,9 (pic 2) 5,72 ± 0,67 a

FC pols (120ºC) 75,04 ± 0,32 b - 4,45 ± 0,42 b

FC pols (130ºC) 74,73 ± 0,87 b - 4,70 ± 0,52 b

FC pols (140ºC) 74,81 ± 0,85 b - 4,64 ± 0,42 b

FC pols (150ºC) 74,20 ± 0,86 b - 4,45 ± 0,21 b

FC pols (160ºC) 74,15 ± 0,61 b - 4,53 ± 0,36 b

(1) Mitjanes de les determinacions fetes com a mínim per triplicat sobre cada mostra (mitjana ±

desviació estàndard).

(2) Temperatura de desnaturalització proteica (pic endotèrmic).

(3) Entalpia de transició del procés de desnaturalització proteica (J·g-1 de mostra).

D’altra banda, si observem la influència de la temperatura a la qual es deshidrata la FC sobre els paràmetres calorimètrics DH i Td de les mostres en pols, sembla que la intensitat de desnaturalització proteica és proporcional a la temperatura utilitzada en el procés de deshidratació per atomització doncs, encara que els valors de la variació de l'Entalpia de transició són força semblants i no s'aprecien gaires diferències, la temperatura de desnaturalització proteica tendeix a disminuir lleugerament a mesura que s’incrementa la temperatura a la qual s'han deshidratat les mostres. Aquest fet indica que un increment de la temperatura utilitzada en la deshidratació produeix una disminució de l'estabilitat tèrmica de la proteïna de la FC i, per tant, una major desnaturalització proteica. La disminució del valor de la Td és bastant progressiva, però de 140 a 150ºC es produeix de forma més marcada. Aquest fet coincideix amb la disminució més acusada de la solubilitat de l'Hb, ja que en aquest interval de temperatura de treball es produeix una reducció més intensa d’aquesta propietat funcional. Tanmateix, l’ANOVA va posar de manifest que no existien diferències significatives (P>0,05) per l'efecte de la temperatura aplicada en el procés de deshidratació sobre les propietats tèrmiques estudiades (Td i

DH) entre les diferents mostres de la FC en pols.

2.4.1.4 Discussió global de la determinació de les condicions de deshidratació de la fracció cel·lular per atomització

En base als resultats obtinguts en l’estudi de la influència de la temperatura utilitzada en la deshidratació per atomització sobre el grau de deshidratació, la solubilitat proteica i l’estabilitat tèrmica de les mostres en pols, es va escollir 140ºC com la temperatura òptima per deshidratar la FC de la sang de porc per atomització. Aquesta temperatura no produeix gaires modificacions de la funcionalitat de la proteïna, com ho indiquen els valors de la seva solubilitat, doncs és significativament semblant a la de les mostres deshidratades a temperatures inferiors (120 i 130ºC); tanmateix, a 140ºC el grau de deshidratació assolit és superior.

Els estudis de l’estabilitat tèrmica de l’Hb per DSC en funció de la temperatura de deshidratació, indiquen que a 140ºC s’ha produït certa desnaturalització, però l’estat de la proteïna és força semblant al de les mostres deshidratades a temperatures inferiors. En definitiva, 140ºC és la temperatura òptima de l’aire per deshidratar per atomització la FC de la sang de porc, sense que el tractament tecnològic aplicat produeixi modificacions importants de l'estructura de l’Hb i, per tant, sense comprometre gaire la seva funcionalitat, doncs la solubilitat es manté al voltant del 95,5 %. Al mateix temps, la deshidratació a 140ºC permet disminuir el contingut en humitat del producte fins a valors del 5 %, que en principi garanteixen un grau de deshidratació segurament suficient per a l’estabilitat microbiològica i bioquímica del producte durant el període de conservació. Tanmateix, aquest aspecte es tornarà a discutir més endavant, en l’apartat de les isotermes de sorció de la FC deshidratada per atomització, mitjançant les quals es relacionarà el contingut en humitat amb l’activitat de l’aigua del producte, donat que la disponibilitat de l’aigua (aw) del producte deshidratat és realment el paràmetre que determinarà la conservació del producte des del punt de vista microbiològic, químic i enzimàtic.

2.4.2 Caracterització microbiològica de la fracció cel·lular

A l’interior de l’organisme dels animals sans la sang és estèril. Tanmateix, durant el procés de dessagnat, recollida i processament a l’escorxador, aquesta es pot contaminar per microorganismes provinents de l’aire, pell, femtes, orina i regurgitacions del contingut digestiu (Swingler, 1982). Les mostres de sang utilitzades en el present estudi provenien d’un escorxador que utilitza un sistema de recollida obert. Encara que aquesta es refrigeri immediatament després de la seva obtenció i s’emmagatzemi en condicions de refrigeració fins al seu processament al laboratori, el sistema de recollida no evita que la sang pugui entrar en contacte amb els diversos contaminats citats anteriorment, fet que es reflecteix en l’elevada contaminació microbiològica que presenta la primera matèria i, en conseqüència, els diferents productes obtinguts després del seu processament.

2.4.2.1 Recompte de microorganismes aerobis mesòfils viables

Els microorganismes aerobis mesòfils són els que presenten una temperatura òptima de creixement entre 30 i 37ºC i que es desenvolupen en presència d’oxigen. El recompte total d’aquests microorganismes és el paràmetre més utilitzat per conèixer la contaminació microbiològica general que presenta un producte alimentari. Dóna informació sobre la qualitat sanitària dels productes analitzats i reflexa les condicions higièniques de la primera matèria, les condicions de manipulació durant l’elaboració i l’emmagatzematge, i l’estat d’alteració dels aliments. De manera que, en general, els recomptes totals baixos en un aliment són indicadors d’una manipulació higiènica o d’un emmagatzematge adequat del mateix. Malgrat això, és important tenir present que els recomptes de la microbiota aeròbia mesòfila estima la microbiota total sense especificar el tipus de microorganisme. Tenen, per tant, un valor limitat. Per exemple, un recompte total baix no sempre reflecteix un bon estat sanitari, doncs encara que l’aliment presenti poca contaminació general, pot presentar microorganismes patògens. També és possible que l’aliment contingui toxines que es mantenen estables, encara que els microorganismes productors d’aquestes no resisteixin les condicions del medi i, per tant, no siguin detectats. Un recompte total elevat tampoc significa, inevitablement, la presència de patògens. Els resultats dels recomptes de microorganismes aerobis mesòfils viables de la FC fresca, la FC hemolitzada per ultrasons i centrifugada, i la FC hemolitzada i deshidratada per atomització a 140ºC es mostren a la Figura 2.9. A partir dels resultats de l’ANOVA, es va veure que existien diferències significatives (P<0,05) entre els 3 tipus de mostres de FC (fresca, hemolitzada per ultrasonicació i hemolitzada i deshidratada per atomització) pel que fa als recomptes de microorganismes aerobis mesòfils. Malgrat tot, el test de separació de mitjanes va diferenciar clarament dos grups: d’una banda, la FC fresca i la FC hemolitzada, amb recomptes de l’ordre de 106 ufc·mL-1 en els dos tipus de mostres i, per altra banda, la FC en pols (reconstituïda al mateix extracte sec que la FC hemolitzada), amb recomptes de l’ordre de 105 ufc·mL-1.

a) Recomptes totals de la fracció cel·lular fresca

Els resultats de les anàlisis realitzades en la caracterització microbiològica de la FC fresca de la sang de porc reflecteixen una elevada contaminació d’aquesta, amb recomptes de microorganismes aerobis mesòfils viables de l’ordre de 106 ufc·mL-1. Aquests resultats coincideixen amb els obtinguts en altres estudis realitzats amb la sang sencera (Ockerman i Hansen, 1994; Parés, 1995), en els quals s’exposava que la càrrega contaminant de la sang és de l’ordre de 105 a 106 ufc·mL-1. El fet pel qual els nivells de contaminació general de la FC fresca coincideixin amb els de la sang sencera es pot explicar per l’efecte que produeix la centrifugació durant el procés de fraccionament de la sang per separar la fracció corpuscular de la fracció plasmàtica. Ockerman i Hansen (1994) expliquen que, després de centrifugar la sang, aproximadament el 20-25 % dels microorganismes queden en el plasma, i el 75-80 % restant a la fracció corpuscular. Donat que el procés de centrifugació de la sang pot produir certa separació dels microorganismes, aquests tendirien a romandre en la fase més densa (FC). Per contra, la fracció plasmàtica, de menor densitat, presentaria una menor contaminació, malgrat que sempre reflecteixi l’elevada contaminació de la sang. Parés (1995) va trobar que la centrifugació de la sang produïa una disminució d’un ordre de magnitud en el plasma, doncs els recomptes totals en aquesta fracció eren de l’ordre de 104 a 105 ufc·mL-1. Aquesta elevada contaminació de la primera matèria ve determinada pel sistema de recollida de sang que utilitza l’escorxador del qual provenien les mostres de sang, amb el qual, com s'ha comentat anteriorment, les possibilitats de contaminació són força elevades.

Per millorar la recollida de la sang i evitar aquesta contaminació, s’han desenvolupat sistemes tancats que incorporen la utilització d’un ganivet balmat, a través del qual la sang flueix des del torrent sanguini cap a un dipòsit estèril, sense entrar en contacte amb les fonts potencials de contaminació. Quan la sang és obtinguda de forma higiènica mitjançant sistemes tancats, els recomptes totals poden arribar a ser de l’ordre de 103 ufc·mL-1 (Lynn Knipe, 1988; Ockerman i Hansen, 1994). Una altra alternativa per controlar la càrrega microbiològica del producte és la de sotmetre’l a algun procediment tecnològic de descontaminació o higienització abans de la seva deshidratació, sempre i quan la tecnologia aplicada no produeixi modificacions de la funcionalitat i de les característiques organolèptiques del producte.

b) Efecte de l'hemòlisi per ultrasons i la centrifugació sobre els recomptes totals

La FC hemolitzada presenta uns recomptes totals de microorganismes aerobis mesòfils lleugerament inferiors als de la FC fresca, abans del tractament d’hemòlisi amb ultrasons i la posterior centrifugació. Malgrat això, no existeixen diferències significatives entre els dos tipus de mostres. A partir d’aquests resultats, podem veure que, tot i que els ultrasons s’utilitzen com a sistema de conservació no tèrmica dels aliments per la seva capacitat d’inactivació o destrucció dels microorganismes, atribuïda als fenòmens de cavitació intracel·lular induïts pels ultrasons (Hoover, 2000; Pascual et al., 1997; Pohlman et al., 1997), en el nostre cas, la ultrasonicació no ha produït una reducció significativa dels recomptes totals. Això pot ser degut a que la intensitat o el temps de tractament aplicats han estat suficients per produir l’hemòlisi dels eritròcits però no per a poder destruir els microorganismes contaminants. Per aconseguir un efecte de descontaminació o higienització de la primera matèria, caldria l'aplicació de tractaments amb ultrasons d’elevada intensitat, els quals poden donar lloc a modificacions físico-químiques i organolèptiques indesitjables del producte. Segons Hoover (2000), els factors crítics que determinen l’eficàcia dels ultrasons són el temps d’exposició dels microorganismes a les ones ultrasòniques, el tipus de microorganisme, el volum i la composició de l’aliment, i la temperatura de tractament. Per altra banda, el procés de centrifugació a 20900 x g durant 30 min, aplicada a la FC després dels ultrasons per separar la solució d’Hb de l’estroma (pellet), tampoc ha produït una disminució significativa dels recomptes totals de la FC fresca. La bactofugació és un procés molt utilitzat a la indústria làctia, que permet sedimentar els bacteris en suspensió en la llet mitjançant l’aplicació d’una força centrífuga de l’ordre de 12000 x g, gràcies a la diferència de densitat entre les cèl·lules i el medi líquid on es troben. A escala industrial, aquest tractament s’aplica en condicions de temperatura d’entre 55 i 75ºC, ja que permet Deshidratació per atomització 56 disminuir la viscositat de la llet i afavorir la separació dels microorganismes. En el cas de la fracció cel·lular, aquesta es centrifugava a temperatura ambient (15-20ºC), donat que un augment de la temperatura altera irreversiblement la funcionalitat del producte i produeix una coagulació proteica. Parés (1998) va observar reduccions d’entre 1,5 i 2 unitats logarítmiques de la contaminació microbiològica del plasma, treballant a temperatura ambient i sota una força centrífuga de 21000 x g. La poca eficàcia de separació dels microorganismes contaminats de la FC hemolitzada mitjançant el procés de centrifugació es pot atribuir a l’elevada viscositat d’aquesta a temperatura ambient respecte a la del plasma o d’altres productes.

c) Efecte de la deshidratació per atomització sobre els recomptes totals

S’ha observat que el tractament de deshidratació per atomització sí que produeix una disminució de la càrrega microbiològica contaminant, doncs els recomptes de microorganismes aerobis mesòfils de la FC en pols (reconstituïda al mateix extracte sec que la FC fresca) són significativament inferiors als de la FC fresca i als de la hemolitzada; concretament es produeix una reducció de l'ordre d'una unitat logarítmica. És força comú que els tractaments de deshidratació produeixin una disminució de la contaminació general dels aliments. A més, en els productes deshidratats, durant el període d’emmagatzematge i a causa de la baixa activitat de l’aigua, es produeix una disminució progressiva de la població microbiana inicial (Frazier i Westhoff, 1988). Tanmateix, el producte deshidratat reflecteix l’elevada contaminació de la primera matèria, ja que presenta uns recomptes totals propers a 105 ufc·mL-1, nivells que segueixen essent massa elevats si aquest producte es vol utilitzar com a additiu alimentari.

2.4.2.2 Investigació i recompte de Staphylococcus aureus

El gènere Staphylococcus pertany a la família Micrococcaceae. Són cocs gram-positius, catalasa positius, aerobis i anaerobis facultatius, no esporulats i immòbils. S. aureus és l’espècie més important des del punt de vista sanitari, doncs algunes soques són responsables d’una intoxicació alimentària produïda per una enterotoxina que causa gastroenteritis i que cursa amb vòmits i diarrees. La majoria de les soques enterotoxigèniques són coagulasa i DNAsa positives, però no tots els estàfils coagulasapositius són necessàriament enterotoxigènics. S. aureus és un dels microorganismes més resistents a activitats d’aigua baixes i es poden desenvolupar fins a valors d’aw de 0,83 a 0,86, encara que per sintetitzar l’enterotoxina requereix una aw de 0,89 (Troller, 1989). L’hàbitat normal de S. aureus és la pell, mucoses i les foses nasals de l’home i els animals. Roberts (1982) descriu les possibles rutes de contaminació del teixit muscular carni: per transferència directa des de la superfície de la canal cap a la carcassa mitjançant els ganivets o altres estris de treball; indirectament per contacte amb l’equipament o l’ambient contaminat en operacions prèvies; i per les mans o la roba dels manipuladors, ja que l’home és el principal reservori per a la transmissió del patogen als aliments durant el seu processament. Quan un aliment presenta un elevat nombre d’estafilococs, en general, significa que el control de la temperatura d’emmagatzematge, els tractaments de neteja i desinfecció, i la manipulació del mateix no han estat adequats. En el nostre producte, la presència d’aquest microorganisme vindrà determinada per la via directa de contaminació de la sang amb la pell de l’animal durant el procés de dessagnat.

Els resultats de l’ANOVA van mostrar que existien diferències significatives (P<0,05) entre els recomptes de S. aureus de la primera matèria (la FC hemolitzada), de l’ordre de 103 ufc·mL-1, i el producte deshidratat reconstituït, que presenta uns recomptes inferiors a 102 ufc·mL-1, essent 102 el llindar de detecció que permet la tècnica. El test de separació de mitjanes va posar de manifest que els dos grups eren significativament diferents. Per tant, la deshidratació per atomització produeix una disminució significativa dels estafilococs presents a la FC hemolitzada de la sang de porc. Aquesta disminució pot ser deguda a que aquest microorganisme és bastant termosensible i no ha resistit les condicions de deshidratació. Tanmateix, les enterotoxines que produeix S. aureus són molt resistents als tractaments tèrmics i poden suportar les elevades temperatures del procés de deshidratació. Des del punt de vista higiènico-sanitari, la FC deshidratada presenta uns recomptes de S. aureus inferiors a 102 ufc·g-1 de pols, que la farien apta per al consum humà. Malgrat això, cal considerar que aquest valor és una mitjana i, entre les mostres estudiades, algunes presentaven recomptes de 102 i 103 ufc·g-1, fet que s’ha de tenir en compte si aquest subproducte es vol utilitzar com a ingredient alimentari, ja que la presència d’aquest microorganisme significa que no s’han pres les suficients mesures higièniques en el procés de recollida i manipulació de la sang. A més, pot ser que el microorganisme no hi sigui present, mentre que les toxines produïdes per aquest, donat que són més resistents, poden romandre en l’aliment, de manera que l’addició de la FC en altres productes alimentaris podria suposar un risc potencial d’intoxicació alimentària. De fet, Parés (dades no publicades), en un estudi realitzat sobre plasma deshidratat de la sang de porc, va trobar presència de toxines de S. aureus en algunes de les mostres estudiades.

2.4.2.3 Investigació i recompte de Clostridis sulfit reductors

Quan es troben microorganismes esporulats en els aliments refrigerats o en els deshidratats, existeix el risc de la presència de clostridis sulfit-reductors, com C. perfringens i C. botulinum. Aquests microorganismes són bacils gram positius, esporulats, anaerobis estrictes, mesòfils i que redueixen els sulfits a sulfurs. En general, aquest grup de microorganismes s’utilitza com a indicadors de contaminació fecal, doncs alguns clostridis formen part de la flora intestinal normal de l’home i els animals, com el C. perfringens, que es sol trobar al sòl, pols, femtes humanes i d’animals, carn crua, pollastre i aliments deshidratats. Els C. perfringens tipus A, C i D són patògens per a l’home, produeixen unes enterotoxines que causen diverses malalties entèriques. Donat que els clostridis formen part de la flora intestinal de l’home i els animals, existeix la possibilitat que C. botulinum hi sigui present. Quan es desenvolupa als aliments, produeix una toxina responsable del botulisme, intoxicació alimentària caracteritzada per un síndrome neurològic, paràlisis musculars, alteracions abdominals i sovint associada a un índex de mortalitat elevat. Malgrat que les toxines són termolàbils (s’inactiva amb un tractament a 80ºC durant 10 minuts o equivalent), les espores de C. botulinum són molt termoresistents i algunes soques són proteolítiques i putrefactives. Els resultats de l’estudi de l’efecte de la deshidratació per atomització sobre els recomptes de clostridis sulfit reductors a la FC de la sang de porc hemolitzada es mostren a la Figura 2.11. La deshidratació per atomització produeix una disminució significativa (P<0,05) dels recomptes de clostridis sulfit-reductors a la FC. El test de separació de mitjanes també va diferenciar clarament els dos grups: la FC hemolitzada, amb recomptes de clostridis de l’ordre de 102 ufc·mL-1, i la FC deshidratada (reconstituïda al mateix extracte sec que la FC hemolitzada), amb recomptes inferiors a 101 ufc·mL-1, essent 101 el llindar de detecció de la tècnica. Tanmateix, malgrat que la majoria de les mostres de FC deshidratades per atomització presenten nivells de contaminació per clostridis inferiors al nivell de detecció de la tècnica, en 3 de les 10 mostres de pols estudiades es van trobar recomptes de l’ordre de 101 ufc·g-1. Des del punt de vista sanitari es recomana l’absència d’aquest grup de microorganismes en un aliment; per aquest motiu, aquesta FC deshidratada s'hauria de considerar no apta per a ús alimentari.

2.4.2.4 Discussió global de la caracterització microbiològica de la FC en pols

Els resultats de la caracterització microbiològica de la FC demostren que el tractament amb ultrasons aplicat per hemolitzar la FC prèviament a la deshidratació, i la centrifugació posterior, no ha disminuït de forma significativa la microbiota contaminat total del producte, almenys a les condicions estudiades; per contra, els recomptes de bacteris aerobis mesòfils si que disminueixen significativament després del procés de deshidratació per atomització. Tanmateix, aquesta FC deshidratada per atomització no seria apta per utilitzar-la com a ingredient per al consum humà. El nostre producte, malgrat que presenti una activitat de l’aigua baixa, obstacle que té un efecte protector enfront el possible deteriorament bioquímic i microbiològic, és susceptible de presentar formes esporulades de clostridis o d’altres espècies de microorganismes resistents a les condicions de dessecació, com per exemple S. aureus o, si més no, les seves toxines. Per tant, en principi, es pot assegurar Deshidratació per atomització 60 l’estabilitat del producte durant l’emmagatzematge enfront el possible deteriorament, però no es pot garantir la seva qualitat higiènico-sanitària quan aquest es reconstitueixi. És important considerar el potencial contaminant del nostre producte, sobretot si pensem en el fet que quan la fracció cel·lular s’addicionarà en un producte alimentari, conjuntament amb altres ingredients, cadascun dels components aportarà la seva pròpia microbiota contaminant, que encara que sigui baixa, en el producte final pot arribar a suposar un risc per a la salut o per a l’estabilitat del producte. Per poder utilitzar aquest subproducte s’haurien de millorar les condicions de recollida a l’escorxador, aplicant una sèrie de mesures encaminades a reduir el risc de contaminació, o bé sotmetre la sang o la fracció cel·lular fresca a algun tractament tecnològic de descontaminació o d’higienització, prèviament al procés de conservació mitjançant la deshidratació per atomització, per evitar o reduir l’elevada contaminació microbiològica de la primera matèria i millorar la seva qualitat higiènico-sanitària.

2.4.3 Caracterització físico-química de la fracció cel·lular hemolitzada i deshidratada per atomització

En aquest apartat s’exposen els resultats de la caracterització físico-química del nostre producte acabat, concretament en base a les característiques de la seva composició química i als components del color de la FC hemolitzada i deshidratada per atomització a 140ºC.

2.4.3.1 Composició química de la fracció cel·lular en pols

La fracció cel·lular de la sang de porc abans de la deshidratació té una concentració de proteïna del 37,2 % (96,6 % sobre l’extracte sec), un contingut d’aigua del 61,5 % i un percentatge de greix del 0,26 % (Parés, 1995). Aquests valors són força propers als trobats a la bibliografia. Ockerman i Hansen (1994) va trobar un 1 % de lípids i entre un 1 i un 3 % de sals minerals, mentre que Ranken (1980) cita un 1,1 % de sals minerals i un 0,4 % de greixos. Cal considerar que existeixen diferències en la composició d’aquesta fracció de la sang entre espècies i fins i tot entre individus de la mateixa espècie. A la Taula 2.4 es presenten els resultats de les anàlisis físico-químiques de la FC hemolitzada i deshidratada per atomització a 140ºC per determinar la seva composició. Com es pot observar, presenta una composició bastant constant doncs les desviacions estàndards són força estretes. El contingut en proteïna representa aproximadament entre el 94 i el 95 % del producte deshidratat i majoritàriament es correspon a l’Hb. Aquest component és el que presenta més variabilitat entre mostres, mentre que en els altres components el marge de variabilitat és força estret. Malgrat tot, cal considerar que aquesta variabilitat es deu a la precisió de la tècnica analítica.

Si comparem les dades del nostre producte amb la composició de la globina dessecada estudiada per Ockerman i Hansen (1994), el percentatge de proteïna és molt semblant i el contingut en sals minerals (3 %) es troba dins de l’interval citat per aquests autors i força proper al 2,3 % trobat per Lynn Knipe (1988). La variabilitat observada en el percentatge de sals minerals ve determinada per la concentració d’anticoagulant afegida a la sang durant el procés de recollida, ja sigui perquè s’utilitzen sistemes de dosificació poc precisos o per la variabilitat en la dosificació en funció de l’escorxador, que en el cas de citrat sòdic pot variar del 0,4 al 0,8 % (p/v) (Parés, 1995). En canvi, el nostre producte té un major contingut en humitat que la globina dessecada segons Ockerman i Hansen (1994) que presenta una humitat del 3,5 % i també és lleugerament superior al 4,5 % d’humitat de la fracció cel·lular deshidratada segons Lynn Knipe (1988); aquestes petites diferències són degudes a les condicions de deshidratació d’aquests productes. En el nostre cas, no hem arribat a un grau de deshidratació tan intens perquè per determinar les millors condicions d'aplicació del procés tecnològic, a part del contingut en humitat final del producte en pols, hem tingut en compte el manteniment de la funcionalitat de la proteïna. També hem trobat un contingut en greix superior que els percentatges que es citen a la bibliografia. El nostre producte presenta quasi un 1 % de greix, concretament un 0,7 %, valor relativament superior al 0,1 % trobat per Lynn Knipe (1988). Malgrat tot, no podem comparar els nostres resultats amb els citats per aquest autor donat que desconeixem l’espècie de la qual procedia la sang i el tipus de tractament aplicat a la fracció corpuscular dessecada.

2.4.3.2 Caracterització dels paràmetres del color de la fracció cel·lular en pols

Com tots els pigments d’estructura tetrapirròlica, l’Hb presenta unes determinades propietats espectrals i colorants, degudes fonamentalment a l’estat del grup hemo. L’estat d’oxidació del ferro del grup hemo (Fe2+ o Fe3+) i la naturalesa dels grups que estan units a la sisena posició d'aquest (O2, NO, CO2, H+) expliquen l’origen de les variacions de color i la reactivitat de l’hemoglobina. El ferro és un metall de transició que disposa d’orbitals buits o incomplets, de manera que la transició d’electrons a aquests orbitals determina l’absorció de la llum en l’espectre visible i, en conseqüència, el color de l’Hb i dels seus derivats. Les modificacions de l’Hb produïdes pels tractaments tecnològics condicionen el color d’aquesta quan s’addiciona als productes carnis. Les principals formes de l’Hb són la desoxiHb, l’oxiHb i la metaHb. La desoxiHb és el pigment natural, té un àtom de ferro en esta ferrós (Fe2+) en el grup hemo. Aquest derivat té un color vermell-porpre i està present quan la pressió parcial d’oxigen és baixa. En presència d’oxigen (atmosfera normal), l’Hb es transforma a oxiHb. Aquest pigment, de color vermell intens, és un complex Hb-Fe2+-O2, relativament estable quan la pressió parcial d’oxigen és elevada. La metahemoglobina (MHb) és una forma oxidada de l’Hb, en la qual el ferro del grup hemo es troba en estat fèrric (Fe3+). Es tracta d’un pigment marronós fosc, generalment indesitjable en els productes carnis. Per això s’han proposat diferents procediments de descoloració de la fracció cel·lular, per poder utilitzar la globina com a additiu alimentari. El poder colorant de l’Hb és poc estable i durant els processos tecnològics o l’emmagatzematge es poden produir canvis en el seu color que es tradueixen en canvis en les coordenades cromàtiques o paràmetres de color (Potter i Hotchkiss, 1995). La desnaturalització de la globina pels tractaments tèrmics o per pHs baixos afavoreix l’autooxidació de l’Hb a metaHb (Cheftel et al., 1989) i aquesta és la responsable de l’aparició d’un color marronós fosc no desitjat. Aquest enfosquiment s’observa quan deshidratem el nostre producte per atomització. Segurament, en la fracció cel·lular en pols el pigment està majoritàriament en forma de metaHb perquè el tractament tecnològic ha produït una oxidació del ferro del grup hemo. El grup hemo de l’Hb presenta dues bandes d’absorció en l’espectre visible. Una d’elles és poc intensa i presenta un màxim d’absorció entre 550 i 660 nm, és la banda Q característica del color vermell del pigment i la seva longitud d’ona d’absorció màxima varia en funció de l’estat de l’hemo (oxiHb o metaHb). La segona banda d’absorció, la banda B o de Soret, és més intensa i presenta un màxim d’absorció a 430 nm (Cheftel et al., 1989).

Els resultats de les determinacions dels paràmetres CIE L*, a* i b* del color de les diferents mostres de fracció cel·lular hemolitzada deshidratades per atomització a 140ºC es mostren a la Taula 2.5. Els valors de les tres coordenades cromàtiques (Lluminositat, To i Saturació) són bastant constants en les diferents mostres estudiades i reflecteixen el color vermell marronós fosc del producte en pols obtingut.

El valor de la coordenada vermell-verd (a*) és força elevat com a conseqüència de la intensa pigmentació vermella que presenta el nostre producte. En molts productes carnis s'ha observat que aquest paràmetre s'incrementa en funció de la concentració dels hemopigments presents. Per exemple, algunes vísceres com el pulmó presenten valors del component vermell elevats (+a*) ja que contenen gran quantitat de sang retinguda i, per tant, una alta concentració d'Hb; en el cor, donat que presenta una major proporció de mioglobina que altres teixits musculars, els valors de la coordenada a* són superiors que els de la carn magra (Pérez-Álvarez et al., 1998). El nostre producte també presenta certa tonalitat groguenca, tal com reflecteix el paràmetre b* (+). La Saturació o Cromacitat (C*), que representa la intensitat o la tonalitat del color resultant de la combinació entre els components a* i b*, està més propera a les tonalitats grisoses que als colors vívids de l'espectre. La lluminositat (L*) és relativament baixa, degut bàsicament a que l'oxidació de l’Hb es tradueix en un enfosquiment o disminució del component L* del color de la fracció cel·lular en pols.

2.4.4 Activitat de l’aigua i isotermes de sorció de la fracció cel·lular

deshidratada per atomització

L’aigua és el constituent principal de quasi tots els aliments en estat natural i té un paper essencial en la seva estructura i textura. La interacció de l’aigua amb els constituents químics dels aliments és el principal factor responsable del comportament de l’aliment Deshidratació per atomització 64 davant els processos de deteriorament i determina la seva relativa estabilitat durant l’emmagatzematge. Donat que la possibilitat que en un aliment es produeixi el desenvolupament dels microorganismes o les reaccions deteriorants en les que intervé l’aigua, depèn de la disponibilitat d’aquesta al producte més que del seu contingut total en aigua, per expressar la susceptibilitat dels aliments a les diferents reaccions químiques i bioquímiques de deteriorament, s’utilitza un paràmetre termodinàmic, l’activitat de l’aigua (aw), que indica la disponibilitat de l’aigua en un aliment. L’activitat de l’aigua és una “propietat fonamental de les solucions aquoses” de gran interès sanitari i tecnològic, ja que condiciona les possibilitats de conservació dels productes alimentaris. Està acceptat de forma generalitzada que l’activitat de l’aigua està més estretament relacionada amb les propietats físico-químiques i biològiques dels aliments i d’altres productes naturals, que el contingut total d’humitat (Rockland i Nishi, 1980). L’aw es defineix com la relació entre la pressió de vapor que exerceix l’aigua d’un aliment a la interfase sòlid-gas (Pw) i la pressió de vapor de l’aigua pura (Pw0), mesurades totes dues a la mateixa temperatura (Scott, 1957; citat per Troller, 1989):

El moviment de l’aigua entre l’aliment i el seu ambient està governat per l’aw. Quan l’aw de l’aliment sigui superior a la de l’ambient, es produirà una deshidratació del producte alimentari, passant l’aigua lliure a l’aire que l’envolta; aquesta pèrdua d’aigua s’aturarà quan les aw de l’aliment i de l’aire s’equilibrin. En el cas contrari, quan l’aw de l’aliment sigui inferior, aquest adsorbirà aigua de l’ambient. Existeixen diferents paràmetres que influencien l’aw dels aliments: temperatura, composició, propietats físiques, força iònica i pH de l’aliment.

a) Temperatura

Per a un mateix sòlid, i a humitat relativa constant, l’aw augmenta quan incrementa la temperatura. En augmentar la temperatura, els enllaços que existeixen dins de l’aliment es trenquen, i així fan incrementar l’aw. És per aquest fet que la conservació en refrigeració allarga la vida útil dels aliments, ja que es disminueix l’aw de la mateixa manera que les temperatures de refrigeració també dificulten les possibles reaccions físico-químiques deteriorants i el desenvolupament microbià.

b) Composició de l’aliment

Segons els ingredients presents als aliments, aquests tenen diferent capacitat de lligar l’aigua als seus punts actius (grups -OH, -NH3 +, -COO-, etc.) i, per tant, varia la quantitat d’aigua lliure o disponible. Per exemple, a la regió de baixes HR, els aliments rics en midó, com els cereals, farines, patates, hortalisses, etc., presenten la màxima capacitat de retenció d’aigua. En canvi, els aliments rics en proteïnes, com la fracció cel·lular i altres productes carnis, lactis, ous i peixos, tenen una capacitat de retenció d’aigua inferior que els amilacis, però superior a la de les fruites (Vidal et al. 1986) i a la dels productes amb elevat contingut en cel·luloses (Christian, 1983-1984).

c) Propietats físiques de l’aliment

L’estat físic en el qual es troba l’aliment, segons tingui una estructura amorfa o cristal·lina, influeix de forma acusada sobre la capacitat de retenció de l’aigua. Aquest estat físic depèn, en gran part, dels tractaments tecnològics aplicats. Els processos de deshidratació, liofilització, congelació, etc., produeixen variacions en l’absorció de l’aigua. Per exemple, l’escalfament del midó produeix una modificació de la seva estructura, perquè en la gelatinització, la xarxa cristal·lina impermeable a l’aigua, es transforma en un estat amorf. La grandària de les partícules de l'aliment també influencia l’aw, ja que l’adsorció d’aigua depèn de la superfície que tingui la partícula, i aquesta superfície està Deshidratació per atomització 66 relacionada amb la grandària de la partícula. Així, com més petites siguin les partícules, més aigua lligaran, fent disminuir l’aw.

d) Força iònica

En funció de la concentració d’ions que existeixi en el medi, aquests, en solvatar-se, lligaran més o menys quantitat d’aigua. Així, quan augmentem la força iònica dels aliments, per exemple en els processos de salat, l’aw disminuirà.

e) pH

Segons el pH, variarà l’estat d’ionització dels grups iònics de l’aliment, així com la seva capacitat de lligar aigua i, per tant, aquesta estarà més o menys disponible.

Influència de l’aw en la qualitat i l’estabilitat dels aliments:

L’aw dels aliments té una influència directa sobre canvis específics que es poden produir en el color, aroma, textura, flavour, estabilitat bioquímica i microbiològica, i en l’acceptabilitat dels productes alimentaris frescos o processats (Rockland i Nishi, 1980). El desenvolupament dels microorganismes en els aliments depèn clarament de diversos paràmetres com la disponibilitat de l’aigua, contingut i concentració de nutrients, pH, temperatura, potencial d’oxidació-reducció, presència o absència de certes substàncies, etc. Així, l’activitat de l’aigua d’un aliment determina el possible creixement de microorganismes patògens i/o deteriorants. En general, una disminució de l’aw suposa un augment de la fase de latència de la corba de creixement dels microorganismes, de manera que disminueix la seva velocitat de creixement. Els valors mínims d’aw per al desenvolupament i la producció de toxines d’alguns microorganismes patògens d’origen alimentari es poden veure a la Taula 2.7.

Taula 2.7: Efecte de l’aw sobre el creixement i la producció de toxines de diferents espècies de microorganismes patògens en aliments. Font: Troller (1989).

Microorganisme aw mínima

Creixement Producció de toxines

Salmonella spp. 0,94 ¾

Clostridium botulinum - tipus A i B 0,93 0,84

Clostridium perfringens 0,95 desconegut

Bacillus cereus 0,93 ¾

Staphylococcus aureus 0,86 0,89

Listeria monocytogenes 0,93 ¾

Vibrio parahemolyticus 0,94 ¾

Aspergillus flavus 0,83 0,78

Aquestes dades suggereixen que a nivells d’aw per sota de 0,78-0,80 no existeix creixement de microorganismes patògens. També indiquen que els fongs filamentosos generalment són més osmotol·lerants que els bacteris pel que fa a la seva capacitat de desenvolupar-se i de produir toxines a baixes aw. Està demostrat que el creixement de la majoria dels bacteris és inhibit a aw inferiors a 0,90 i per a la majoria de fongs filamentosos i llevats entre 0,88 i 0,80 (Troller, 1989). Des del punt de vista microbiològic es poden classificar els aliments en tres categories: aliments d’humitat alta (HMF), l’aw dels quals varia entre 0,9-1,0; aliments d’humitat intermitja (IMF), amb una aw entre 0,6- 0,9; i aliments de baixa humitat (LMF), amb una aw entre 0,0-0,6. En el deteriorament de molts HMF, l’acció dels microorganismes és decisiva, mentre que pels IMF només és rellevant l’acció de certs tipus de microorganismes osmòfils o osmotol·lerants i en els LMF el creixement microbià està pràcticament inhibit (Vidal i Bornhardt, 1991). Els enzims deteriorants presents als aliments poden ser endògens o bé ser secretats per microorganismes que creixen en l’aliment. L’aigua promou de diverses formes l’activitat enzimàtica: com a mitjà de difusió i desplaçament, solvent dels substrats, reactiu durant la hidròlisi, estabilitzant de l’estructura i configuració dels enzims, font d’hidrogen per formar enllaços entre grups polars o com a medi on s’alliberen els productes de la reacció. A mesura que augmenta l’aw de l’aliment, la velocitat de les reaccions enzimàtiques s’accelera (Figura 2.12). Aquest increment s’atribueix a un augment en la mobilitat dels enzims. En la regió de la capa monomolecular (aigua fortament lligada) la mobilitat és nul·la i, per tant, l’activitat enzimàtica no és possible (Troller, 1989). Figura 2.12: Representació de les velocitats relatives d’alteració dels aliments en funció de l’aw i les propietats de sorció d'humitat dels productes alimentaris (Rockland i Beuchat, 1987).

L’efecte de l’aw en l’oxidació dels lípids és una mica complex. Les reaccions d’autoxidació dels greixos són les úniques reaccions de deteriorament dels aliments que tenen lloc a qualsevol valor d’aw, fins i tot a aw baixes, malgrat que en l’interval d’aw entre 0,2 i 0,4 es produeixen més lentament. S’ha observat que si s’augmenta la concentració d’aigua fins a valors intermitjos, aquesta té un efecte protector enfront l’oxidació. S’han proposat diverses hipòtesis que expliquen els mecanismes de la disminució de l’oxidació autocatalítica dels lípids per valors d’aw baixos o l’efecte protector a valors d’aw elevats (Karel, 1973; Pomeranz, 1991; Troller, 1989). Les reaccions d’enfosquiment no enzimàtic o reaccions de Maillard es produeixen als aliments com a resultat de processos d’escalfament, deshidratació o concentració, donant lloc fonamentalment a modificacions de les característiques organolèptiques dels aliments, sobretot del color i del flavour, però també produeixen una alteració del valor nutritiu ja que els compostos de les reaccions de Maillard provenen d’una sèrie de reaccions hidrolítiques no enzimàtiques entre sucres reductors i aminoàcids. La possibilitat que es produeixin aquestes reaccions depèn directament de l’aw i presenta el grau màxim entre 0,5 i 0,8 (Figura 2.12). A baixes activitats de l’aigua, el factor limitant és la dificultat de mobilitat, degut fonamentalment a l’augment de viscositat que va assolint el producte a mesura que perd aigua (Troller, 1989); mentre que a aw altes, l’enfosquiment s’inhibeix per l’efecte de dilució dels substrats de la reacció per la presència de gran quantitat d’aigua lliure (Karel, 1973).

Relació entre l’aw i el contingut en aigua: Isotermes de sorció

Si es col·loca un aliment higroscòpic en contacte amb una atmosfera d’humitat relativa i temperatura constants, aquest guanyarà o perdrà aigua fins a assolir un contingut d’humitat determinat, anomenat humitat d’equilibri. En aquest moment, la pressió de vapor de l’aigua sobre la superfície de l’aliment (P) serà igual a la pressió parcial del vapor d’aigua a l’ambient que envolta al producte (Pw).

Una isoterma de sorció d’humitat és la corba que indica, en l’equilibri i a una temperatura determinada, la quantitat d’aigua retinguda per un producte en funció de l’aw , o el que és equivalent, en funció de la humitat relativa de l’atmosfera que envolta l’aliment. Dit d’una altra manera, s’anomena isoterma de sorció d’humitat d’un aliment, a la pressió parcial de vapor que exerceix l’aigua de l’aliment en funció del seu contingut en aigua, en l’equilibri i a una temperatura constant.

Si un aliment higroscòpic es troba en un ambient amb una HR superior a la HRE corresponent al seu contingut en humitat, aquest fixarà vapor d’aigua fins que assoleixi l’equilibri. Aquest fenomen es coneix com adsorció, i les isotermes d’equilibri obtingudes seguint aquest procediment són les isotermes d’adsorció. En el cas contrari, si l’aliment es posa en contacte amb un ambient on la seva HR és inferior a la HRE corresponent al contingut d’humitat del producte, cedirà vapor d’aigua a l’ambient i es dessecarà, o millor dit, patirà un procés de desorció. En aquest cas s’anomenen isotermes de desorció. En general, per a un mateix producte i a una temperatura determinada, la isoterma d’adsorció no es superposa a la de desorció (Figura 2.13). Aquesta no coincidència de les dues isotermes s’anomena histèresi i és especialment més pronunciada en la zona intermèdia de les isotermes d’equilibri, que es correspon amb l’aigua lligada de forma dèbil a la capa monomolecular. El fenomen de la histèresi té una gran influència sobre el comportament dels aliments en els processos d’adsorció o de desorció d’aigua. Per a un producte amb el mateix contingut en aigua, s’estableix l’equilibri en la desorció a un valor d’aw corresponent a una pressió parcial de vapor d’aigua menor que l’adsorció. De manera que, a una mateixa aw, el contingut en humitat d’un producte en la isoterma d’adsorció, en general, és inferior al de la desorció, especialment en els productes frescos i naturals (Karel, 1973; Rockland i Nishi, 1980).

Les isotermes de sorció dels productes alimentaris poden presentar diferents formes, encara que la més freqüent és la forma sigmoïdal (Jimenez i Arraiz, 1980; Vidal et al., 1986; Wolf et al., 1972). La zona A indicada en la Figura 2.13 correspon a l’aigua fortament lligada a l’aliment, en forma de capa monomolecular, fixada als grups polars de certs compostos; i també a l’aigua de cristal·lització de les sals i sucres. Aquesta part de l’aigua no està disponible per actuar com dissolvent o reactiu (Vidal et al., 1986) i tampoc es pot congelar. Per sobre de la zona A, les isotermes poden dividir-se en dues o més regions, corresponents a l’aigua cada vegada més disponible i formades per capes successives d’aigua dèbilment lligada a la monomolecular mitjançant ponts d’hidrogen. Finalment, a valors d’aw per sobre de 0,75 es troba l’aigua lliure, que representa la major part de l’aigua dels aliments frescs o processats (no els deshidratats), present en dissolucions, retinguda per capil·laritat o per forces de naturalesa osmòtica (Wolf et al., 1972).

Interès tecnològic de les isotermes de sorció

Les isotermes de sorció, que representen la relació funcional entre l’aw i el contingut en aigua en equilibri d’un aliment, a temperatura i pressió constants, són de gran interès en la tecnologia alimentària, ja que permeten predir entre d’altres: les propietats de lligar aigua dels materials dels aliments; el temps de deshidratació dels productes alimentaris i fer una estimació de l’energia necessària pel procés d’assecament; les condicions d’equilibri quan es mesclen ingredients amb diferents activitats de l’aigua; l’estabilitat microbiològica i bioquímica en funció del contingut en aigua d’un producte; i el comportament dels aliments durant el període d’emmagatzematge, i per tant, la vida comercial útil dels aliments (Vidal i Bornhardt, 1991). Les condicions d’emmagatzematge o els diferents processos tecnològics que s’apliquen als aliments produeixen canvis significatius en la seva qualitat, que estan associats a canvis en la histèresi de les isotermes de sorció. Així, estudiant els canvis produïts en la histèresi, es pot determinar el deteriorament de la qualitat que ha sofert el producte (Wolf et al., 1972). Per exemple, en la producció d’aliments deshidratats que s’han de rehidratar abans de la seva comercialització, hom pot trobar que el producte presenta una aw molt superior a l’esperada.  Les isotermes de sorció varien amb la temperatura i, principalment, segons la composició del producte (Banwart, 1982). En un estudi fet amb quatre proteïnes (gelatina, ovoalbúmina, caseïna i queratina) es va observar que les diferents formes que presentaven les corresponents isotermes eren degudes a les diferents estructures proteiques, composició en aminoàcids i altres característiques físico-químiques de les proteïnes, així com a canvis produïts pels tractaments tèrmics aplicats (Hägerdal i Löfqvist, 1973). En un altre estudi fet amb diferents fibres alimentàries, també es va observar la diferent forma que presentaven les isotermes de sorció, deguda principalment a canvis en l’estructura de cada tipus de fibra, que produeixen modificacions en les propietats de lligar o adsorbir aigua (Cadden, 1988). A la Taula 2.8 es mostren els valors de l'activitat de l'aigua a 20ºC de tres mostres de FC (A, B i C) hemolitzades i deshidratades per atomització a 140 ºC, obtinguts pel mètode de la interpolació gràfica. A la Taula 2.9 es poden observar les mitjanes de les dades experimentals dels continguts en humitat (g aigua per 100 g de sòlids) de les tres mostres diferents de FC deshidratades per atomització a 140 ºC estudiades (A, B i C) en funció de la seva activitat de l’aigua a 20ºC.

Les isotermes de sorció a 20ºC de la FC hemolitzada i deshidratada per atomització es mostren a la Figura 2.14. Els valors obtinguts en la determinació gravimètrica de la isoterma d’adsorció de la FC deshidratada per atomització s’han ajustat a una funció sigmoïdal mitjançant regressió no lineal i el coeficient de regressió obtingut és molt elevat (R2=0,998). La representació gràfica de la isoterma de desorció s’ha realitzat de forma aproximada a partir de les dades experimentals donat que no existeix cap model que permeti el seu ajustament.

Les isotermes de sorció a 20ºC de la FC deshidratada per atomització presenten una forma sigmoïdal característica dels productes alimentaris, és a dir, una zona inicial convexa, una zona intermèdia força lineal i una zona final còncava. El contingut en humitat en equilibri de la fracció cel·lular en pols augmenta quan incrementa l’activitat de l’aigua a temperatura constant i disminueix quan disminueix l’aw, tant en l’adsorció com en la desorció. Aquesta forma sigmoïdal és més accentuada en aliments amb un elevat contingut en proteïnes (Kapsalis, 1981; Wolf et al., 1972) i s’atribueix a diferències qualitatives en l’afinitat per l’aigua dels sòlids higroscòpics (Castillo, 1997). A les isotermes de la Figura 2.14 es poden diferenciar tres segments en funció de l’aw, força coincidents amb les regions que normalment s’observen a les isotermes de forma sigmoïdal. Aquestes regions representen els tres principals mecanismes de lligam de l’aigua al producte segons l’aw d’aquest (Cadden, 1988; Rockland i Nishi, 1980). En primer lloc, fins a valors d’aw de 0,25, s’observa una zona inicial convexa, corresponent a la regió de la monocapa o d’aigua fortament lligada mitjançant ponts hidrofílics sobre els punts polars dels components de l’aliment. Aquesta part de l’aigua no està disponible per actuar com a dissolvent o reactiu. En la FC deshidratada estaria representada per l’aigua lligada als grups iònics de l’Hb (NH3 + i COO-). La segona regió o zona intermèdia, des de valors d’aw de 0,25 fins a 0,75, és més aviat lineal i es correspondria amb la regió de la multicapa, una zona de transició en la qual l’aigua està cada cop més dèbilment lligada mitjançant ponts d’hidrogen. En tercer lloc, a partir de nivells d’aw de 0,75 i fins a 1,0, s’observa la secció final còncava de les isotermes, que es correspondria a la regió d’aigua unida per capil·laritat, condensada sobre la multicapa o aigua lliure, en la qual estan dissolts la major part dels components del sistema, com els aminoàcids lliures o els sucres.

En la regió intermèdia de les isotermes de la FC, aquestes no coincideixen, o el que és el mateix, la isoterma d’adsorció no es superposa a la de desorció. Aquest comportament diferent, que s’observa en forma de bucle a la representació gràfica, es correspon a la histèresi i, en el nostre cas, és força estreta i llarga si la comparem amb la que normalment s’observa a les isotermes dels productes alimentaris. En efecte, a la Figura 2.14 podem observar que a un mateix valor d’aw, per exemple 0,4, el contingut en aigua del producte en la isoterma de desorció és superior (11 %) que el de la isoterma d’adsorció (9 %). La histèresi comença a valors d’aw superiors a 0,2 i les dues isotermes no tornen a coincidir fins a valors per sobre de 0,8; aquesta zona es correspon fonamentalment a la regió intermèdia de la isoterma, és a dir, on l’aigua està lligada de forma dèbil a la capa monomolecular.

Segons Wolf et al. (1972), la histèresi de les isotermes és una característica molt important per conèixer el comportament dels diferents aliments en els processos de sorció de vapor d’aigua, doncs proporciona informació addicional, de la qual no se’n disposaria si s’estudiessin la isoterma d’adsorció i de desorció de forma aïllada o per separat. La histèresi indica que existeix un mecanisme de protecció natural dels aliments enfront a determinades condicions d’humitat ambiental, com per exemple la pèrdua d’aigua en una atmosfera seca o la humidificació. Aquest comportament observat en la histèresi de les isotermes de la FC en pols també és característic en molts aliments amb un elevat percentatge de proteïna, com la carn i els llegums (Kapsalis, 1987). Les proteïnes tenen més capacitat de retenció de l’aigua que els lípids o els sucres i això determina que no existeixin tantes diferències entre les isotermes d’adsorció i les de desorció i, per tant, que la histèresi sigui més estreta. El fet que les isotermes de sorció de la FC en pols presentin una histèresi força estreta també és un fet bastant comú en els productes deshidratats, en els quals el contingut en humitat en la isoterma de desorció és significativament inferior, a la mateixa aw, que la dels productes frescos o naturals (Rockland i Nishi, 1980). A partir de les dades experimentals es va calcular la isoterma d’adsorció, ajustant els valors d’aw i els percentatges d’humitat experimentals segons el model GAB (proposat per Guggemhein-Anderson-de Boer) (Jouppila i Ross, 1994; Kaminski i Al-Bezweni, 1994; Roos, 1993). Els coeficients de regressió i l’equació obtinguts mitjançant l’ajustament de les dades experimentals a una funció polinòmica de segon grau (Figura 2.15) es poden veure a la Taula 2.10. Finalment es va obtenir la isoterma d’adsorció a 20ºC de la FC deshidratada per atomització segons el model GAB que es mostra a la Figura 2.16.

La isoterma d’adsorció de la FC deshidratada per atomització, obtinguda segons l’ajustament de les dades de sorció experimentals al model proposat per Guggenheim- Anderson-De Boer (GAB), també presenta una forma sigmoïdal. Sembla que l’equació GAB és un bon model per a les dades obtingudes de forma experimental, doncs la funció polinòmica de segon grau de la Figura 2.15, on es va representar l’aw en funció de aw/m (a partir de les dades obtingudes gravimètricament) per determinar els coeficients de regressió a partir dels quals es va aplicar el model GAB, presentava un coeficient de correlació força elevat (R2 = 0,945).

L’equació GAB és un bon model per estudiar el comportament d’adsorció del nostre producte deshidratat durant el període d’emmagatzematge. El contingut en humitat inicial mitjà de la FC deshidratada per atomització a 140ºC és del 5,56 % (sobre extracte sec). Segons les isotermes de sorció obtingudes experimentalment, aquest percentatge d’humitat es correspon a un valor d’aw a 20ºC d’aproximadament el 0,2, valor que coincideix amb els valors obtinguts en la determinació gravimètrica de l'aw en les mostres A, B i C de fracció cel·lular deshidratades per atomització a 140ºC (Taula 2.9), mentre que segons la isoterma d’adsorció obtinguda pel model GAB, l’aw del producte després de la deshidratació seria del 0,165.

És important destacar que fins a valors d’aw de 0,2-0,25, encara ens trobem en la regió de la isoterma d’aigua fortament lligada a la proteïna en forma monocapa i aquesta aigua està molt poc o gens disponible. De manera que el contingut en humitat que s’assoleix després de la deshidratació de la FC hemolitzada es correspon, segons les isotermes de sorció, a una aw prou baixa per garantir la conservació de FC en pols, sempre i quan aquesta s’envasi amb materials d’envasament tipus barrera que no permetin l’entrada d’humitat de l’exterior, doncs el desenvolupament de microorganismes patògens i/o deteriorants i la producció de toxines estan totalment inhibits, i la major part de les reaccions químiques i enzimàtiques de deteriorament no es poden produir. A partir del model GAB també podem calcular el valor del contingut en aigua corresponent a la capa monomolecular d'aigua que recobreix la superfície de cada partícula (Mm). Aquest paràmetre reflexa el contingut en humitat que permet la màxima estabilitat en la majoria dels aliments perquè les reaccions microbiològiques i bioquímiques de deteriorament són mínimes (Castillo, 1997; Leung, 1987). En el cas de la FC deshidratada per atomització a 140ºC, el contingut en humitat de la capa monomolecular és del 5,86 % (Taula 2.10) i l’aw en la qual existeix la monocapa en aquest producte segons l’equació GAB és de 0,188. Donat que el percentatge d’humitat i l’aw inicial del nostre producte en pols són menors que els valors en els quals existeix la monocapa, la conservació de la FC deshidratada està força garantida i pot tenir una vida útil bastant prolongada, sempre que s’envasi i emmagatzemi adequadament. A les condicions d'activitat de l'aigua que existeixen al producte deshidratat només es poden produir reaccions d’autoxidació dels greixos (Troller, 1989). Tanmateix, encara que el nostre producte presenta un contingut en lípids bastant baix, inferior a l'1 % i, en principi, aquest tipus de deteriorament hauria de ser mínim, és important tenir en compte que el ferro del grup hemo pot actuar com a potent promotor o catalitzador de les reaccions d’oxidació autocatalítica dels greixos (Potter i Hotchkiss, 1995). Aquest fet, conjuntament amb els problemes de l’enfosquiment inherents a la FC, determinen la conveniència de l’eliminació del grup hemo de la fracció corpuscular quan aquest producte es destina a l’alimentació humana (Wismer-Pedersen, 1988). Per aquestes raons, per garantir el bon estat de conservació del producte, seria interessant estudiar el grau d’oxidació lipídica que es produeix durant el període d’emmagatzematge i, en funció dels resultats obtinguts, tenir la precaució d’envasar la fracció cel·lular deshidratada en condicions d’absència d’oxigen i protegida de la llum.

2.5 CONCLUSIONS

La ultrasonicació permet produir l'hemòlisi dels eritròcits de la FC de la sang de porc amb la finalitat d'alliberar l'Hb del seu interior abans de la deshidratació per atomització. Les condicions considerades com a òptimes són tres períodes de 2 minuts a 75 W amb 1 minut de descans entre tractaments.

La millor temperatura de deshidratació per atomització de la FC hemolitzada és 140 ºC, tenint en compte el màxim grau d'assecament de la mostra sense que es produeixi una disminució important de la solubilitat de la proteïna. La FC hemolitzada i deshidratada per atomització presenta un contingut en humitat del 5,3 % i un percentatge de solubilitat proteica del 96 %. El procés tecnològic de deshidratació per atomització produeix modificacions dels paràmetres calorimètrics de la FC, fet que indica que la deshidratació indueix canvis en l'estructura nativa de l'Hb i, per tant, cert grau de desnaturalització proteica que pot conduir a una disminució de les seves propietats funcionals. La càrrega contaminant de la FC fresca de la sang de porc és força elevada i el tractament amb ultrasons utilitzat per hemolitzar-la i la centrifugació posterior no produeixen una reducció significativa de la microbiota contaminant, obtenint un producte amb uns recomptes microbiològics de l'ordre de 106 ufc·mL-1. La deshidratació per atomització produeix una disminució d’una unitat logarítmica dels recomptes totals de la FC hemolitzada. Malgrat tot, el producte deshidratat encara reflecteix l'elevada contaminació de la primera matèria i és susceptible de presentar S. aureus i formes esporulades de clostridis sulfit-reductors, fet que condiciona negativament la seva utilització com a ingredient per a la indústria alimentària, a no ser que es millorin les condicions de recollida de la sang a l'escorxador o que aquesta o la FC es sotmeti a algun tractament d'higienització prèviament a la deshidratació.

L'extracte sec de la FC hemolitzada i deshidratada per atomització a 140ºC està composat per un 94,6 % de proteïna, un 3 % de sals minerals i un 0,7 % de greix. Els valors de les coordenades de color CIE L*a*b* de la FC en pols són força constants i reflecteixen el color vermell marronós fosc d'aquesta, degut fonamentalment a que durant la deshidratació es produeix una oxidació del ferro hèmic de l'Hb.

Les isotermes de sorció a 20ºC de la FC deshidratada per atomització tenen una forma sigmoïdal i presenten una histèresi estreta i llarga. L'equació GAB és un bon model matemàtic per ajustar les dades de sorció obtingudes experimentalment i determinar la isoterma d'adsorció de la FC deshidratada per atomització, per conèixer la relació funcional entre el contingut en humitat i l'activitat de l'aigua del producte en pols. El percentatge d'humitat de la FC deshidratada a 140 ºC es correspon, segons la isoterma d’adsorció obtinguda pel model GAB, a un valor d’aw a 20 ºC d'aproximadament el 0,17. Tenint en compte que ens troben per sota dels valors d'aw corresponents a la capa monomolecular, podem garantir la conservació a temperatura ambient del producte, sempre i quan aquest s'envasi en recipients tancats que no permetin l'entrada d'humitat de l'exterior.

Capítol 3 81

Capítol 3: Estabilització del color de la fracció cel· lular deshidratada per atomització per utilitzar-la com a colorant alimentari.

3.1 INTRODUCCIÓ

Malgrat que el poder colorant de l’hemoglobina suposa un handicap quan es vol afegir la FC com a ingredient en determinats aliments, i que es tendeix a sotmetre-la a diferents procediments de descoloració, la fracció corpuscular també es podria utilitzar com a un colorant alimentari d’origen natural en productes carnis per proporcionar diferents coloracions vermelles.

Els colorants naturals es consideren generalment com additius innocus, de manera que les limitacions específiques per a la seva utilització són menors que les que afecten als colorants artificials. Malgrat això, els naturals són menys estables i solen ser més cars que els obtinguts per síntesi química. Entre els diferents colorants vermells d’origen natural autoritzats trobem: el vermell Cotxinilla o àcid carmínic (E-120), obtingut a partir de les femelles d’uns insectes paràsits d’algunes espècies de cactus, és el colorant natural amb millors característiques tecnològiques, però la seva utilització està limitada pel seu elevat preu; la capsantina i capsorubina (E-160c) són els pigments del pebre vermell (Paprika) que s’utilitza com a colorant i aromatitzant en molts embotits i és força resistent a la llum i a la temperatura; el vermell remolatxa o betanina i betalaïna (E-162) és l’extracte aquós de la remolatxa vermella que resisteix les condicions àcides però s’altera fàcilment amb l’escalfament, especialment en presència d’aire, i es torna de color marró; i alguns antocians (E-163) responsables dels colors vermells, blaus i violetes de fruites i flors.

La possibilitat d’aprofitar la FC com a colorant alimentari és especialment interessant en aquells països en els que no estan permesos els colorants vermells artificials i, alhora, quan la FC es vulgui utilitzar pel seu elevat contingut en ferro, aprofitant el valor nutritiu de l’hemo, i en proteïnes amb molt bona funcionalitat.

Tanmateix, tal com s’ha descrit al Capítol 2, durant el procés de conservació de la FC mitjançant la deshidratació per atomització, es produeix un enfosquiment del producte perquè l’aire calent accelera l’oxidació del ferro del grup hemo de l’Hb, que passa a metaHb, pigment de color marró fosc en el qual el ferro està en forma fèrrica. En conseqüència, seria interessant trobar algun sistema que permeti protegir el color de la FC i estabilitzar el color vermell de l’Hb durant la seva deshidratació i posterior emmagatzematge del producte en pols. Una alternativa podria ser la deshidratació amb un fluid calefactor diferent de l’aire, com el CO2 o el N2, però aquesta tecnologia encariria molt el procés de deshidratació i no seria rendible econòmicament, i tampoc podem garantir l’estabilitat del color durant el període d’emmagatzematge.

També es podria utilitzar la liofilització per conservar la FC, tot i que és un procés molt car només aplicable a productes d’elevat valor afegit. Malgrat això, al nostre grup de recerca, s’han fet alguns estudis de l’aplicació de la liofilització per conservar la FC i es va veure que, si bé el color de la FC acabada de liofilitzar era millor que el de la FC deshidratada per atomització, la primera s’oxidava molt més ràpidament que l’atomitzada durant el període d’emmagatzematge (Altarriba, 2001). La major susceptibilitat a l’oxidació de la FC liofilitzada la van atribuir, per una banda, a la porositat del producte, que determinava una major superfície de contacte amb l’oxigen i, per l’altra, al menor contingut en humitat respecte de les mostres atomitzades. Sembla que el contingut en aigua residual dels productes assecats pot exercir cert efecte protector enfront les reaccions d’oxidació perquè dificulta l’accessibilitat de l’oxigen al grup hemo, mentre que valors d’humitats massa baixos, per sota de la capa monomolecular, poden fer que els ions metàl·lics quedin més exposats a l’oxidació.

Es va plantejar doncs, la possibilitat d’afegir algun additiu a la FC que tingués una activitat protectora enfront l’oxidació que es produeix durant la deshidratació, perquè el color vermell del producte es mantingui estable. Les possibles substàncies que es podien assajar havien de ser compostos amb activitat antioxidant o reductora i/o agents segrestants o quelants del ferro, de manera que el pigment hemo es mantingués estable enfront l’oxidació. També es va plantejar d’estudiar si la capacitat d’inhibició de l’oxidació de l’Hb de les diferents substàncies afegides es mantenia durant el període emmagatzematge del producte en pols.

Substàncies amb activitat antioxidant

Els antioxidants són aquelles substàncies que afegides a productes alimentaris prevenen, eviten o retarden les reaccions d’oxidació catalitzades per l’acció de l’oxigen, elevades temperatures, llum, elements metàl·lics, complexes enzimàtics o els microorganismes. Com a antioxidants alimentaris s’utilitzen diferents tipus de compostos amb activitat reductora, consumidors d’oxigen, segrestants o quelants.

Els antioxidants o agents reductors frenen les reaccions d’oxidació perquè ells mateixos són els que s’oxiden més fàcilment que el substrat al qual protegeixen i, per tant, endarrereixen l’alteració oxidativa de l’aliment però no l’eviten d’una forma definitiva. Els agents quelants o segrestants tenen la capacitat de lligar els ions metàl·lics (com el coure i el ferro) que faciliten l’oxidació dels greixos i això fa que contribueixin en l’estabilització del color, aroma i textura dels aliments. En el nostre cas, el que ens interessaria és quelar el ferro hemínic. Hi ha molts constituents naturals dels aliments que poden actuar com a agents quelants, per exemple: àcids dicarboxílics (oxàlic, succínic), hidroxiàcids (làctic, màlic, tartàric, cítric), àcid etilendiamonitetraacètic (EDTA), àcids polifosfòrics (ATP, pirofosfats), alguns aminoàcids, pèptids i proteïnes. Donat que les traces d’ions metàl·lics poden actuar com a catalitzadors de l’oxidació dels greixos, el seu lligam amb els agents quelants incrementa l’eficiència de l’activitat dels antioxidants (efecte sinèrgic amb els antioxidants primaris) i inhibeix l’oxidació de l’àcid ascòrbic i de vitamines liposolubles (E i D). De manera que, per exemple, algunes aplicacions dels agents quelants són millorar l’estabilitat de l’aroma i el color de productes vegetals tractats per calor, evitar la coagulació de la sang i l’agregació de les caseïnes en productes lactis (Belitz i Grosch, 1999).

3.2 OBJECTIUS

L’objectiu del present capítol és investigar el possible efecte estabilitzant del color vermell de la FC en pols d’algunes substàncies potencialment antioxidants a diferents concentracions. Amb aquesta finalitat, es vol determinar si l’addició de diferents concentracions de substàncies amb activitat antioxidant i/o segrestant del Fe hèmic (àcid ascòrbic, dextrina, glucosa, L-cisteïna, àcid nicotínic i nicotinamida) a la FC de la sang de porc evita l’enfosquiment oxidatiu que es produeix durant la deshidratació per atomització d’aquest producte.

També s’estudiarà si l’efecte antioxidant o protector del color es manté durant el període d’emmagatzematge de la FC en pols, determinant l’evolució en el temps del color de la FC deshidratada per atomització en funció del tipus d’antioxidant utilitzat i de la concentració afegida.

3.3 MATERIAL I MÈTODES

3.3.1 Disseny experimental

Per determinar l’efecte potencialment antioxidant i/o segrestant del Fe de cada substància es van dissenyar una sèrie d’experiments aleatoritzats per blocs complets. Els assaigs es van portar a terme sobre 5 mostres diferents de FC hemolitzada procedent de sang de porc (5 repeticions) per a cadascuna de les substàncies antioxidants assajades (àcid ascòrbic, dextrina, glucosa, L-cisteïna), mentre que en els cas de l’àcid nicotínic i la nicotinamida, es va fer sobre 3 repeticions de FC hemolitzada, ja que en la primera part de l’estudi es va veure que els resultats eren força reproduïbles malgrat la variabilitat entre mostres.

Cada mostra es va dividir en cinc alíquotes, a les quals es van addicionar diferents concentracions de l’antioxidant: 0 % (control); 0,25; 0,5; 1 i 2 % (p/v) abans de deshidratar-les per atomització. En el cas de la nicotinamida, les concentracions afegides van ser: 0; 1; 1,5; 2 i 2,5 % (p/v). Finalment, es va avaluar l’evolució dels paràmetres CIE L*a*b* del color de la FC en pols obtinguda de cada alíquota durant un període de dos mesos d’emmagatzematge, prenent mesures el dia zero (mostres acabades de deshidratar), els dies 1, 2, 3, 5 i 7 i després en intervals cada 7 dies fins el dia 63.

3.3.2 Addició dels antioxidants a la fracció cel·lular i deshidratació de les mostres per atomització

Es van utilitzar mostres de sang de porc recollides del tanc d’emmagatzematge en refrigeració d’un escorxador industrial de característiques descrites a l’apartat 2.3.2 i les mostres de fracció cel·lular hemolitzada es va obtenir segons el mateix procediment descrit a l’apartat 2.3.3. Tots els experiments es van realitzar amb mostres de sang recollides en diferents dies però en les mateixes condicions.

Com a possibles additius antioxidants i/o quelants es van escollir sis substàncies que són additius alimentaris àmpliament utilitzats. Aquest foren: Àcid Ascòrbic (E-330) i Dextrina LSN, ambdós per a ús alimentari industrial (SBI, Systems Bio-Industries, S.A., Rubí, Barcelona), D (+)-Glucosa PRS-CODEX (Panreac Química, S.A., Montcada i Reixach, Barcelona), L-Cisteïna (Merck KgaA, Damstadt, Alemanya), Àcid Nicotínic i Nicotinamida, ambdós de Sigma (Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Steinhem, Alemanya). Les diferents concentracions dels additius s’afegien al concentrat d’Hb obtingut després de l’hemòlisi i posterior centrifugació de la FC, just abans de la seva deshidratació per atomització. Donat que l'addició dels àcids ascòrbic i nicotínic produïa una acidificació de la FC proporcional a la dosi afegida (fins a pH 6,34 en el cas d’afegir-ne un 2 % d’ascòrbic i pH 5,5 amb un 2 % de nicotínic), s’ajustava el pH d'aquesta a 7,4-7,5 (pH natural de la FC control) amb NaOH 1 N. En el cas dels altres antioxidants assajats, es comprovava que es mantenia el mateix pH que el de la FC fresca.

Les mostres de FC hemolitzada amb l’antioxidant sempre es van deshidratar per atomització el mateix dia d’haver recollit la sang. Les condicions del procés de deshidratació van ser les mateixes que les descrites a l’apartat 2.3.3 del capítol 2. Les mostres en pols es van emmagatzemar a temperatura ambient al laboratori en recipients de plàstic tancats durant tot el temps que va durar l’assaig.

3.3.3 Determinació del color

L’evolució dels paràmetres del color CIE L*, a* i b* en el temps durant un període de dos mesos es va determinar amb un colorímetre Minolta CR-300 (Minolta Co., Ltd., Osaka, Japó) segons la metodologia descrita a l’apartat 2.2.6.2. Cada determinació es va fer individualment sobre cada mostra per triplicat.

3.3.4 Tractament estadístic de les dades

L’anàlisi estadística dels resultats obtinguts es va realitzar mitjançant l’anàlisi de la variància (ANOVA) de mesures repetides amb les dades log-transformades, utilitzant el procediment GLM (General Linear Model) disponible al paquet estadístic SAS (SAS Institute, Inc., 1990). Aquest tractament va permetre estudiar els efectes entre factors (efecte de la concentració d'antioxidant afegida i de la mostra de FC o repetició), i els efectes intra factors (efecte del temps d’emmagatzematge i de les interaccions entre ambdós tipus d'efectes, temps*concentració d'antioxidant i temps*mostra). Es van considerar com a significatius els valors de probabilitat inferiors a 0,05. Per a la comparació múltiple de mitjanes es va aplicar el test de Tukey-Kramer HDS amb un nivell de significació de P=95 %.

3.4 RESULTATS I DISCUSSIÓ

En aquest apartat s’exposen els resultats obtinguts en la determinació dels efectes de l’addició de diferents substàncies antioxidants i/o segrestants del Fe a la FC hemolitzada, per estabilitzar el seu color i evitar o disminuir l’enfosquiment oxidatiu que es produeix durant la deshidratació per atomització i el posterior emmagatzematge del producte en pols a temperatura ambient.

3.4.1 Efecte de l’addició d’àcid ascòrbic

L’àcid L-ascòrbic o vitamina C (E-300) és un dels antioxidants naturals més amplament utilitzat a la indústria alimentaria. Els seus efectes antioxidants es deuen a que protegeix els dobles enllaços i també segresta l’oxigen. Les seves propietats redox li permeten actuar com a agent reductor i com a segrestant de radicals lliures; a més, la seva capacitat d’actuar com a un agent sinèrgic fa que pugui reconvertir els productes oxidats en la seva forma reduïda (Niki et al., 1984, a: Núñez-Delicado et al., 1997). L’àcid ascòrbic i les seves sals (ascorbat sòdic E-301 i ascorbat càlcic E-302) s’utilitzen molt com antioxidants en productes carnis, conserves vegetals, sucs de fruita, begudes refrescants, i en la cervesa per eliminar l’oxigen de l’espai de cap. En la tecnologia dels productes carnis, l’ascòrbic i els seus derivats també eviten la formació de nitrosamines. Tanmateix, l’addició d’àcid ascòrbic com antioxidant en un aliment no permet fer un ús publicitari de l’enriquiment en vitamina C de l’aliment. En productes de panificació i rebosteria, l’àcid ascòrbic s’utilitza com a millorant de les masses. La farina té un enzim, l’àcid ascorbicoxidasa, que transforma l’ascòrbic en àcid dehidroascòrbic (ADHA), el qual té efectes oxidants sobre les proteïnes formadores de gluten i per això s’utilitza per augmentar la força de les farines.

L’oxidació de l’àcid ascòrbic a ADHA depèn de diversos paràmetres com la pressió parcial d’oxigen, el pH, la temperatura i la presència d’ions metàl·lics. La presència d’aquests últims, particularment Cu2+ i Fe3+, fa que la velocitat de la reacció de destrucció de l’ascòrbic sigui més ràpida que l’autoxidació espontània no catalitzada per metalls. L’àcid ascòrbic, el dehidroascòrbic i els seus productes de degradació, en presència d’aminoàcids, es poden transformar en compostos de color marró a través de les reaccions d’enfosquiment no enzimàtic. Un exemple d’aquest fenomen és la reacció del ADHA amb compostos amino per donar pigments marronosos que causen l’enfosquiment indesitjable en sucs de fruits cítrics i fruites deshidratades (Belitz i Grosch, 1999). A les Figures 3.1, 3.2 i 3.3 es mostren els valors de l’evolució de L*, a* i b* en el temps en funció de la concentració d’àcid ascòrbic afegida. Es pot observar que l’addició de les diferents concentracions d’àcid ascòrbic a la FC té un efecte significatiu sobre la variació de tots els paràmetres del color.

La concentració d’ascòrbic afegida afectava significativament (P<0,05) el paràmetre L* del color (lluminositat). Globalment, s’observava una tendència a incrementar el valor de L* en augmentar la concentració d’àcid ascòrbic. Tanmateix, només l’addició d’un 2 % d’ascòrbic suposava un augment significatiu de la lluminositat respecte de les mostres control, tant a l’inici com al final de l’experiment. També s’ha observat una variació significativa durant el temps d’emmagatzematge i un efecte significatiu de la mostra sobre l’evolució de L*. Malgrat tot, la pauta de variació que experimentava el paràmetre L* durant els dos mesos d’emmagatzematge no depenia significativament de la concentració d’antioxidant afegida. L’increment de lluminositat experimentat per la FC en pols demostra que una addició del 2 % d’ascòrbic té cert efecte blanquejant i redueix el fenomen de l’enfosquiment que produeix el procés de deshidratació per atomització.

Per altra banda, la concentració d’àcid ascòrbic afectava de forma significativa (P<0,05) als valors a* i b* del color. En augmentar la concentració d’ascòrbic, disminueixen les tonalitats vermella i groga del producte respecte de les mostres control. El temps d’emmagatzematge tenia un efecte molt significatiu (P<0,05) sobre els valors a* i b* en tots els tractaments. El descens de la coordenada vermella (a*) es produïa fonamentalment durant el primer dia després de la deshidratació, a partir del qual, aquest paràmetre tendia a estabilitzar-se. Malgrat que no existia un efecte significatiu de la concentració sobre la disminució de a* durant el període d’emmagatzematge, al finalitzar l’assaig es va observar que l’efecte d’un tractament era significativament diferent de qualsevol altre, seguint una relació inversa, és a dir, a major concentració d’àcid ascòrbic, menor era la tonalitat vermella del producte. També s’ha observat que la variació d’a* depenia significativament de la mostra.

Quant a la coordenada groc-blau (b*), la seva disminució durant l’emmagatzematge depenia de forma significativa (P<0,05) tant de la concentració d’antioxidant com de la mostra. Els tractaments amb un 2 % d’àcid ascòrbic presentaven una pauta de variació durant l’emmagatzematge diferent al de les altres concentracions. La tonalitat groga de les mostres amb un 2 % d’ascòrbic tendeix a augmentar progressivament durant l’emmagatzematge, però el valor de b* és menor que el de les mostres sense ascòrbic. Està descrit que en productes carnis el comportament del valor de b* sol ser similar al del paràmetre a* (Pérez-Álvarez et al., 1998). La disminució de les tonalitats vermella (a*) i groga (b*) del color produïda per l’addició d’ascòrbic sembla indicar que aquest additiu, encara que disminueix l’enfosquiment (produeix un augment del valor de L*), no evita l’oxidació del ferro de l’Hb, com per permetre una millora de la tonalitat del color.

Aquests autors van trobar que el tractament de la llet amb àcid ascòrbic protegia de forma eficaç a la riboflavina de la fotodegradació i que inhibia la disminució dels paràmetres verd (-a*) i groc (+b*) que es produeix per l’exposició de la llet a la llum. Aquesta activitat protectora del color i del contingut en riboflavina de la llet la van atribuir a la capacitat que té l’àcid ascòrbic de lligar l’oxigen.

Per contra, Carlez et al. (1995) van investigar els efectes de l’addició de diferents agents reductors com àcid ascòrbic, nicotinamida i àcid nicotínic, a la carn picada de vedella, per prevenir els efectes negatius de l’alta pressió hidrostàtica sobre el color de la carn. Van observar que l’addició de nicotinamida i àcid nicotínic feia disminuir lleugerament el valor de a*, però produïa un increment del b*, i això es traduïa en què les mostres additivades fossin lleugerament més grogues i més grisoses que les no tractades. L’addició d’àcid ascòrbic a la carn picada per evitar l’oxidació de la mioglobina a metaMb, tampoc tenia un efecte protector del color. Aquests autors van trobar que l’ascòrbic provocava una disminució del paràmetre a* i un increment de la concentració de metaMb. Alguns autors han suggerit que l’àcid ascòrbic pot actuar com a pro-oxidant a elevades concentracions o en presència d’ions metàl·lics com el coure o el ferro lliure o lligat (Mitsumoto et al., 1991).

En conseqüència, donat que la FC és una font important de ferro, podria passar que l’ascòrbic s’oxidés a ADHA, a expenses de la reducció del Fe3+ a Fe2+, la qual cosa tindria un efecte protector enfront l’oxidació del grup hemo. Tanmateix, hem observat que la presència d’àcid ascòrbic a la FC afavoreix la conversió de l’Hb en metaHb durant la deshidratació i l’emmagatzematge. Això es tradueix en l’obtenció d’un producte en pols de color més marró que les mostres control, com a resultat de la disminució dels components vermell i groc del color, però a la vegada menys fosc, a causa de l’augment de la lluminositat.

La vitamina C, en concentracions superiors al 0,5 % (5000 ppm) en una solució d’Hb, pot actuar com a pro-oxidant i, en concentracions inferiors al 0,02% en una solució de carotèlinoleat, pot actuar com a pro-oxidant en presència d’ions metàl·lics (Kanner et al., 1977, a: Mitsumoto et al., 1991). Per tant, quan s’utilitzi la vitamina C en baixes concentracions, és necessària l’addició de quelants dels metalls per suprimir o evitar les reaccions prooxidants, o bé la utilització d’una combinació de varis additius amb activitat antioxidant. Mitsumoto et al. (1991) van estudiar l’efecte de l’addició de vitamina E (a-tocoferol), vitamina C (àcid L-ascòrbic) i la seva combinació (Vit E+C) sobre l’estabilitat dels pigments i dels lípids en carn de vedella picada. Van trobar que la màxima oxidació de la mioglobina a metaMb i l’oxidació lipídica es produïa a les mostres no tractades. L’oxidació del pigment i dels lípids era moderada a les mostres tractades amb Vit E i baixa a les tractades amb Vit C, mentre que la combinació Vit E+C era la que permetia la mínima oxidació (efecte sinèrgic). Sembla que una excessiva addició de Vit E a la carn podria accelerar l’oxidació lipídica i alhora causar una major oxidació de la Mb en comparació amb les mostres no tractades. Tanmateix, l’efecte sinèrgic de l’addició de Vit E+C permetia el manteniment del color vermell brillant i prevenia la rancidesa de la carn picada, i això possiblement era causat perquè la Vit E actua com a antioxidant primari i la Vit C pot regenerar de nou Vit E.

3.4.2 Efecte de l’addició de dextrina

Les dextrines estan formades per varis residus de D-glucosa de longitud de cadena intermèdia, que s’obtenen a partir del midó mitjançant la hidròlisi àcida o amb amilases. A la indústria alimentària, les dextrines s’utilitzen principalment com a agents espesseïdors i estabilitzats de suspensions, però donat que són carbohidrats reductors, tenen una activitat antioxidant potencial. Addicionalment, presenten l’avantatge que són uns productes molt econòmics.

A les Figures 3.4, 3.5 i 3.6 es mostren els valors de l’evolució de L*, a* i b* en el temps en funció de la concentració de dextrina afegida. De forma global, s’observa una tendència a augmentar la lluminositat del producte a major concentració de dextrina. Tanmateix, l’augment del paràmetre L* del color a causa d’un increment de la concentració no era significatiu. Per altra banda, es va trobar un efecte significatiu (P<0,05) del temps d’emmagatzematge sobre la lluminositat de totes les mostres. Durant la primera setmana d’emmagatzematge es produïa una lleugera disminució de la lluminositat i després tendia a estabilitzar-se.

La concentració de dextrina no afectava significativament a les coordenades a* i b* del color, malgrat que s’observava un increment de la tonalitat groga (+b*) a partir d’un 0,5 % de dextrina. Per altra banda, existia una variació significativa (P<0,05) de les coordenades a* i b* durant el temps d’emmagatzematge. Durant la primera setmana d’emmagatzematge es produïa un descens marcat de les tonalitats vermella i groga del color i després disminuïen de forma lenta o tendien a estabilitzar-se, fonamentalment a les mostres control.

S’ha proposat la utilització de la dextrina o derivats, com les ciclodextrines, com a antioxidants secundaris d’origen natural per potenciar l’efecte de l’antioxidant principal (àcid ascòrbic) als aliments, per reduir els nitrats en productes carnis curats (Núnez- Delicado, et al., 1997), o com agents encapsuladors per protegir el color dels pigments de productes carnis curats cuits (Shahidi i Pegg, 1991). En el nostre estudi, la dextrina havia de tenir un comportament reductor; tanmateix, no ha presentat els efectes que esperàvem. En efecte, les diferents concentracions de dextrina addicionades al concentrat d’Hb no han estabilitzat de forma significativa el color durant l’emmagatzematge del producte. Per tant, aquesta substància no presenta una activitat protectora de l’oxidació del grup hemo de la FC.

3.4.3 Efecte de l’addició de glucosa

La D-glucosa és un sucre reductor molt utilitzat a la indústria alimentaria. Entre les seves possibles aplicacions com a additiu antioxidant cal destacar que evita les oxidacions produïdes per la presència d’oxigen en aliments i begudes, redueix els nitrats als productes carnis curats, inhibeix l’oxidació d’alguns pigments carnis i millora la conservació del color. També s’uneix al Fe2+ hèmic de forma estable per formar glicosilHb.

L’evolució dels valors CIE L*a*b* del color de la FC en pols en funció de la concentració de glucosa es mostren a les Figures 3.7, 3.8 i 3.9. La concentració de glucosa tenia un efecte significatiu (P<0,05) sobre els paràmetres L* i b* del color, mentre que no té cap efecte sobre el paràmetre a*. L’addició d’un 1 o un 2 % de glucosa incrementava significativament la lluminositat del producte tant al principi com al cap de dos mesos d’emmagatzematge. El mateix comportament es va observar amb el 2 % de glucosa sobre la tonalitat groga (+b*). Durant el període d’emmagatzematge s’observava una disminució significativa de la lluminositat i de les coordenades vermella i groga del color de la FC en pols.

També es va observar una interacció significativa (P<0,05) entre el temps i la mostra sobre els 3 paràmetres de color, i entre el temps i la concentració sobre el paràmetre a*, de manera que la disminució de L*, a* i b* depenia de la mostra, i l’evolució del paràmetre a* en el temps era diferent en funció de la concentració de glucosa afegida. Malgrat que les mostres amb un 2 % de glucosa eren lleugerament més vermelles que la resta, a partir d’un mes d’emmagatzematge ja no s’observaven diferències entre cap dels tractaments assajats.

La presència d’oxigen i de cations metàl·lics a la FC pot fer disminuir l’efecte reductor de la glucosa, fonamentalment al cap d’uns dies de la seva addició, i no tindria un efecte antioxidant suficient per protegir al grup hemo de l’oxidació durant el període d’emmagatzematge. Tanmateix, tal com hem observat amb l’addició de l’àcid ascòrbic, la glucosa redueix significativament l’enfosquiment del producte deshidratat, obtenint un producte marró menys fosc que quan no s’afegeixen substàncies antioxidants.

3.4.4 Efecte de l’addició de L-Cisteïna

La L-Cisteïna (E-920) és un aminoàcid reductor amplament utilitzat en panificació com a additiu millorant, en forma de clorhidrat de cisteïna, amb efectes contraris als produïts per l’àcid dehidroascòrbic, és a dir, quan l’objectiu és reduir els enllaços disulfur de les proteïnes del gluten per disminuir la força de les farines. La cisteïna quan s’oxida es converteix en cistina, la qual està formada per dos residus de cisteïna units per un pont disulfur.

L’evolució dels valors CIE L*a*b* del color de la FC en pols en funció de la concentració de L-Cisteïna afegida es mostren a les Figures 3.10, 3.11 i 3.12. En general, es pot observar que l’addició de cisteïna no ha tingut un efecte protector sobre la lluminositat de la FC. L’anàlisi estadística va mostrar que la concentració de cisteïna no tenia un efecte significatiu sobre la lluminositat de la FC en pols. En canvi, si que existia un efecte significatiu de la mostra sobre els valors de L*.

L’evolució de la lluminositat de les diferents mostres depenia significativament (P<0,05) del temps d’emmagatzematge. Els valors de la lluminositat disminuïen ràpidament durant els primers 5 dies d’emmagatzematge, i després disminuïen d’una forma progressiva i, a la vegada, bastant irregular, independentment de la concentració de cisteïna afegida. Aquesta oscil·lació observada en l’evolució de L* es deu a la variabilitat que existeix entre les diferents mostres de FC, que justifica l’efecte significatiu de la mostra. L’evolució de la lluminositat en el temps que va durar l’assaig era diferent en funció de la mostra o repetició de FC (interacció significativa temps*mostra).

Pel que fa als efectes de la cisteïna sobre els valors de les coordenades vermell-verd (a*) i groc-blau (b*) de la FC en pols es va observar que, en general, totes les mostres additivades eren menys vermelles i menys grogues que les mostres control. Els valors de a* i b* disminuïen significativament (P<0,05) en incrementar la concentració de cisteïna afegida. L’efecte de la cisteïna sobre els paràmetres a* i b* és molt semblant al comportament observat quan s’afegeix ascòrbic, és a dir, un augment de la concentració de cisteïna fa disminuir les tonalitats vermella i groga de la FC. En el cas del paràmetre a*, les mostres control eren significativament més vermelles que les que contenien cisteïna. Després de la deshidratació, el valor de a* de les mostres amb un 2 % de cisteïna era de 20,2, unes 3,5 unitats inferior al de les mostres control (23,8). Quant al paràmetre b*, també es va trobar que la seva variació depenia de la mostra (P<0,05).

Quant a l’efecte del temps d’emmagatzematge sobre els valors a* i b*, existia una variació significativa (P<0,05) de les tonalitats vermella i groga durant els 2 mesos que va durar l’assaig, en tots els tractaments. També es va observar una interacció significativa (P<0,05) de la mostra de FC (repetició) i de la concentració amb el factor temps, la qual cosa significa que tant el descens de la coordenada vermella (a*) com el de b* (groga) durant l’emmagatzematge, depenien de la concentració de cisteïna afegida i de la mostra. La coordenada vermella (a*) disminueix fonamentalment durant la primera setmana després de la deshidratació, a partir de la qual, la disminució d’aquest paràmetre és moderada fins aproximadament uns 20 dies d’emmagatzematge. Després, aquest paràmetre experimentava una pauta de disminució més progressiva, malgrat que en les mostres control, sembla que el color vermell tendeix a estabilitzar-se. Al cap de 2 mesos, la diferència entre el valor de a* de les mostres amb un 2 % de cisteïna i les mostres control era d’unes 6 unitats, arribant a valors de a* de 12,8 i 18,7, respectivament. En el cas de l’evolució de b* durant l’emmagatzematge, també es va observar una reducció marcada del color groc durant els 5 primers dies després de la deshidratació, mentre que després disminuïen més lentament.

Per tant, a diferència de l’àcid ascòrbic i la glucosa, que produeixen un aclariment de la FC, la cisteïna no només no evita l’enfosquiment oxidatiu que es produeix durant la deshidratació, sinó que a més produeix una disminució del color vermell i groc del producte. La cisteïna, a les dosis assajades, no té cap efecte protector del color de la FC i afavoreix l’oxidació de l’Hb a metaHb durant l’emmagatzematge.

Segons Carlez et al. (1995), que van estudiar els efectes de l’addició de diferents antioxidants o estabilitzats del color (àcid nicotínic, nicotinamida, àcid ascòrbic, cisteïna i nitrit sòdic) per prevenir els canvis de color en la carn de vedella picada, quan es sotmet a un tractament amb altes pressions hidrostàtiques, van observar que l’addició de cisteïna abans de la pressurització no tenia efectes significatius sobre els valors de L*, a* i b* respecte de les mostres no additivades.

Algunes substàncies reductores poden afavorir les reaccions de formació de nitrosil mioglobina (NO-Mb), pigment responsable del color dels productes carnis curats, a partir de nitrit metaMb (MetMb-NO2). S’ha vist que la cisteïna pot tenir la mateixa eficàcia reductora que l’ascòrbic sobre la metaMb, per estabilitzar el color de pastes fines tipus frankfurt, després d’haver eliminat l’oxigen i de la cocció, a determinades condicions de pH (6) i temperatura (40ºC). Però en presència d’oxigen, l’ascorbat és més efectiu que la cisteïna (Fox i Ackerman, 1968). L’aire calent utilitzat durant la deshidratació, i la presència d’oxigen a l’interior de l’envàs de la FC durant l’emmagatzematge segurament han determinat la pèrdua de l’activitat reductora de la cisteïna als nostres assaigs. A partir dels resultats obtinguts amb l’àcid ascòrbic, dextrina, glucosa i cisteïna, es va continuar investigant en la possibilitat d’afegir altres compostos antioxidants o segrestants del ferro a la FC per estabilitzar el color vermell del grup hemo. Concretament, s’han assajat els efectes de l’addició de l’oxalat sòdic, fumarat sòdic, àcid nicotínic, nicotinat sòdic i la nicotinamida (Altarriba, 2001; Lorca, 2001). Entre aquests últims, les sals sòdiques de l’oxàlic, fumàric i nicotínic no presentaven gaire eficàcia quant a impedir o evitar l’oxidació de l’Hb durant la deshidratació i l’emmagatzematge. Per contra, amb l’addició d’àcid nicotínic i de nicotinamida es van observar resultats positius sobre el color de la FC.

3.4.5 Efecte de l’addició d’àcid nicotínic

L’àcid nicotínic és la forma en la qual es troba la vitamina hidrosoluble Niacina o Nicotinamida (factor PP antipel·lagra) als aliments (Belitz i Grosch, 1999). L’àcid nicotínic és un additiu utilitzat com a regulador del pH (E-375) i també pot actuar com a agent segrestant d’ions metàl·lics; per tant, potencialment, pot quelar el Fe de l’Hb i evitar la seva oxidació. L’evolució de L*, a* i b* en el temps i en funció de la concentració d’àcid nicotínic es pot observar a les Figures 3.13, 3.14 i 3.15. L’addició de les diferents concentracions d’àcid nicotínic a la FC tenia un efecte significatiu sobre la variació dels 3 paràmetres del color. També es va observar un efecte significatiu de la mostra i que l’evolució de L*, a* i b* durant el període d’emmagatzematge depenia significativament de la mostra, com a conseqüència de l’elevada variabilitat entre les repeticions de FC.

La lluminositat (L*) de la FC en pols depenia significativament (P<0,05) de la concentració d’àcid nicotínic, fonamentalment quan la dosi era de l’1 i el 2 %. Aquestes mostres eren més clares que les control i les que tenien concentracions inferiors de nicotínic. Pel que fa a l’evolució de L* en el temps, també es va observar una variació significativa (P<0,05) durant l’emmagatzematge i, al cap dels 2 mesos, la lluminositat de les diferents mostres era lleugerament inferior a la que presentaven just acabades de deshidratar, però les additivades amb un 1-2 % seguien sent més clares que la resta després d’aquest temps. D’altra banda, la concentració d’àcid nicotínic tenia efectes significatius (P<0,05) sobre les coordenades vermella (a*) i groga (b*) del concentrat d’Hb en pols. També es va trobar que el temps d’emmagatzematge tenia efectes significatius sobre l’evolució d’ambdós paràmetres i que la seva variació depenia de la concentració afegida. Durant els primers 5-7 dies després de la deshidratació, aquests paràmetres disminuïen d’una forma més marcada i, a partir de la primera setmana, la disminució de a* era més progressiva, mentre que b* es mantenia força estable. Les mostres amb un 2 % de nicotínic presentaven valors de a* (28) molt superiors que els de les mostres control i la resta de concentracions (23-24), però no diferien gaire de les que tenien un 1 % (25-26). Al cap de 63 dies, les mostres amb un 2 % de nicotínic presentaven valors de a* de 23, unes 5-6 unitats superiors a la resta (17), mentre que respecte de les additivades amb un 1 % (19), la diferència era d’unes 4 unitats. D’altra banda, en el cas de la coordenada groga (b*), l’addició d’un 2 % de nicotínic determinava que les mostres fossin unes 2-3 unitats més grogues (18) que les que contenien un 1 % (16,5), i les que tenien un 0,25-0,5 % de l’additiu i les control (15,5). Al final de l’emmagatzematge, la coordenada groga havia disminuït lleugerament, aproximadament 1 unitat, per a totes les concentracions.

L’addició d’un 2 % (p/v) d’àcid nicotínic a la FC evita considerablement l’enfosquiment produït per la deshidratació i l’emmagatzematge posterior, i permet l’obtenció d’una pols de FC més clara, més vermella i més groga que la FC control. L’increment d’ambdues coordenades cromàtiques (a* i b*) es tradueix en què la pols tingui un color marronós a causa de l’augment de b*. Tal com s’ha comentat anteriorment, el comportament del paràmetre b* sol ser força similar al del paràmetre a* (Pérez-Álvarez et al., 1998). Tanmateix, l’àcid nicotínic a aquesta concentració és capaç d’estabilitzar el poder colorant del concentrat d’Hb en pols durant el període d’emmagatzematge. L’àcid nicotínic es va patentar per utilitzar-lo com a estabilitzant del color en carns; Coleman et al. (1949, 1951; a: Kendrick i Watts, 1969) van descriure la formació d’un pigment de color vermell, producte de la reacció entre l’àcid nicotínic i la Mb. Està descrit que l’àcid nicotínic i la seva amida formen un complex vermell estable amb la Mb, similar al que es forma amb NO (Cheftel i Cheftel, 1976).

Donat que l’addició d’un 2 % de nicotínic tenia efectes molt favorables sobre el color de la FC en pols, es va intentar optimitzar la dosi òptima d’aquest i es van assajar les concentracions de 0; 1,5; 2 i 2,5 %. Tanmateix, l’addició d’un 2,5 % de nicotínic produïa una disminució del pH, que repercutia negativament sobre les característiques cromàtiques i la solubilitat de l’Hb de la FC. Per tant, es va decidir assajar els efectes de l’addició de nicotinamida a la FC a concentracions de l’1; 1,5; 2 i 2,5 %.

3.4.6 Efecte de l’addició de nicotinamida

La nicotinamida s’obté a partir de l’àcid nicotínic substituint el grup àcid d’aquest per un grup amida. La nicotinamida, en forma de nicotinamida adenina dinucleòtid (NAD+) o la seva forma fosforilada (NADP+) és un coenzim de deshidrogenases (Belitz i Grosch, 1999). A les Figures 3.16, 3.17 i 3.18 es mostren els valors dels paràmetres L*a*b* en funció de la concentració de nicotinamida afegida a la FC i la seva evolució durant l’emmagatzematge. Les diferents concentracions de nicotinamida tenien un efecte significatiu sobre els 3 paràmetres del color. També es va observar que l’evolució de L*, a* i b* durant l’emmagatzematge depenia significativament de la mostra de FC en pols, a causa de la variabilitat entre les repeticions. Pel que fa a la Lluminositat, existia un efecte significatiu (P<0,05) de la concentració, així com una variació significativa d’aquest paràmetre durant el període d’emmagatzematge. El valor de L* disminuïa durant els primers dies i després s’estabilitzava. Les mostres amb nicotinamida eren més clares que les control, malgrat que l’increment de la lluminositat era superior amb una concentració del 2,5 %. Aquest comportament és molt similar a l’observat amb un 1 % d’àcid nicotínic.

En referència al paràmetre a*, aquest era significativament superior (P<0,05) en augmentar la concentració de nicotinamida. Tanmateix, els valors de la coordenada a* eren molt semblants entre les mostres additivades amb concentracions de 1,5, 2 i 2,5 %. Existia una variació significativa del paràmetre a* durant el període d’emmagatzematge i la pauta de variació depenia de la concentració afegida. La coordenada vermella del color de la FC disminuïa ràpidament durant la primera setmana i després més lentament. Alguns autors han descrit que la nicotinamida té capacitat de formar complexes amb el grup hemo, incrementant els valors de a* (Ahn i Maurer, 1990). Tanmateix, la nicotinamida presenta una menor capacitat d’evitar l’oxidació del Fe que l’àcid nicotínic. Pot ser que la naturalesa àcida d’aquest últim sigui responsable del millor comportament segrestant per part del nicotínic. Segons Maccarrone et al. (1987), l’addició d’antioxidants i àcids poden millorar el color d’alguns productes després de sotmetre’ls a un tractament.

Per una altra banda, la concentració i el temps d’emmagatzematge també tenien efectes significatius (P<0,05) sobre el paràmetre b*. La coordenada groga era lleugerament superior en incrementar la dosi de nicotinamida. En totes les concentracions, la variació de b* en el temps era molt similar, durant els primers 15 dies es produïa un descens lleuger, després es mantenia bastant estable i, a partir de l’última setmana, tornava a disminuir. Al final del període d’emmagatzematge, les mostres amb un 2,5 % de nicotinamida presentaven una tonalitat groga més elevada que la resta. De forma global, hem observat que l’addició de nicotinamida a la FC fa que el grup hemo sigui menys susceptible a l’oxidació produïda tant durant la deshidratació com durant el període d’emmagatzematge. Els resultats més positius s’han obtingut amb l’addició d’un 2,5 %, sobretot quant a la lluminositat, perquè s’obté una pols molt més clara i més vermella, però a la vegada més groga i, això es tradueix en un color marronós. Tanmateix, amb l’addició d’un 2 % d’àcid nicotínic s’obtenien valors molt més elevats de la coordenada vermella i, per tant, una protecció més eficaç enfront de l’enfosquiment produït durant la deshidratació i l’emmagatzematge de la pols.

3.5 CONCLUSIONS

De l’estudi del possible efecte estabilitzant del color de la FC deshidratada per atomització mitjançant l’addició d’additius amb activitat potencialment reductora i/o segrestant del ferro hemínic, s’ha observat que només l’addició d’àcid ascòrbic o glucosa i l’àcid nicotínic i la nicotinamida, té efectes positius sobre el color del producte en pols. En tots els assaigs realitzats s’observen canvis de color en la FC, provocats pel tractament de deshidratació, que són característics de l’oxidació de l’Hb. A més, durant els 2 mesos d’emmagatzematge, el color segueix evolucionant i s’aprecia un augment progressiu de l’enfosquiment i la tonalitat marró.

L’àcid ascòrbic i la glucosa no milloren la conservació del color de l’Hb, modifiquen els paràmetres a* i b*, però disminueixen l’enfosquiment que es produeix durant la deshidratació per atomització, amb la qual cosa, es pot obtenir un producte en pols de color marró més clar que sense l’addició d’aquests antioxidants. Al final del període d’emmagatzematge, les mostres additivades amb un 2 % d’ascòrbic o un 1-2 % de glucosa són més clares que la FC control.

L’addició de dextrina o L-cisteïna no disminueix l’enfosquiment que es produeix durant la deshidratació de la FC ni evita el canvi de color de l’Hb. L’efecte de les diferents concentracions de dextrina no produeix variacions significatives en cap dels 3 paràmetres del color de la FC en pols, donat que aquests disminueixen durant el temps d’emmagatzematge, sense que existeixi una relació entre les diferents concentracions de dextrina. D’altra banda, la cisteïna, no només no protegeix a la FC de l’enfosquiment, sinó que produeix una disminució de les tonalitats vermella i groga de la pols, que és proporcional a la concentració de cisteïna.

Per últim, l’àcid nicotínic i la nicotinamida protegeixen el color de l’Hb durant el procés de deshidratació i el període d’emmagatzematge de la FC en pols. L’addició d’un 2 % d’àcid nicotínic a la FC evita considerablement l’enfosquiment produït per la deshidratació i l’emmagatzematge posterior i permet l’obtenció d’una pols de FC més clara, més vermella i més groga que la FC control. Per altra banda, es va trobar que la FC additivada amb un 2,5 % de nicotinamida, també era menys susceptible a l’enfosquiment o canvi de color produït tant durant la deshidratació com durant el període d’emmagatzematge. Finalment, malgrat que s’han observat efectes positius sobre la lluminositat amb els antioxidants àcid ascòrbic i glucosa i sobre la tonalitat vermella amb els quelants àcid nicotínic i nicotinamida, no es descarta la utilització combinada de varis additius per protegir el color de la FC en pols d’una forma més eficaç. Es podrien afegir diferents reductors o una combinació d’aquests amb agents segrestants, per exemple l’àcid ascòrbic o la glucosa, que produeixen un aclariment de la pols, en combinació amb àcid nicotínic o nicotinamida, que protegeixen el color vermell, per investigar si existeixen efectes sinèrgics o complementaris entre aquestes substàncies.

Capítol 4: Higienització de la fracció cel·lular mitjançant el

tractament amb altes pressions hidrostàtiques.

4.1 INTRODUCCIÓ

Com hem vist anteriorment, l’elevada contaminació microbiològica de la sang és la principal limitació per a la utilització de les fraccions de la sang a la indústria alimentària. Per millorar la qualitat microbiològica de les fraccions de la sang és necessari trobar un mètode de descontaminació o higienització efectiu que permeti mantenir el valor nutritiu i les propietats organolèptiques i funcionals d’aquests productes. Donat que els tractaments tèrmics modifiquen o danyen irreversiblement la fracció cel·lular i les seves proteïnes, es requereix un mètode de conservació no tèrmic. Tal com s’ha descrit en el capítol 2, la deshidratació per atomització és un bon sistema per conservar la FC de la sang de porc. Tanmateix, la FC deshidratada per atomització encara reflecteix l’elevada contaminació microbiològica del producte de partida. Es planteja, doncs, l’aplicació d’un sistema d’higienització, prèviament al procés de deshidratació, que permeti reduir la microbiota contaminant de la FC.

Les tecnologies no tèrmiques de conservació dels aliments estan emergent com a processos alternatius o complementaris als mètodes tradicionals de conservació dels aliments. Els diferents tractaments no tèrmics de conservació dels aliments (altes pressions hidrostàtiques, camps elèctrics polsants d’elevada intensitat, camps magnètics oscil·lants, polsos de llum d’elevada intensitat, microfiltració tangencial, radiacions ionitzants, llum ultravioleta d’ona curta, ultrasons, processos combinats basats en la teoria dels obstacles, entre d’altres) permeten obtenir productes estables des del punt de vista microbiològic, sense que es produeixin els efectes col·laterals negatius dels tractaments de conservació amb aplicació de calor sobre les qualitats nutritives i sensorials dels aliments. L’alta pressió hidrostàtica està guanyant importància a la indústria alimentaria a causa dels avantatges que presenta en la inactivació de microorganismes i enzims i en la producció d’aliments d’alta qualitat (Mertens i Knorr, 1992, a: Barbosa-Cánovas et al., 1998).

Altes pressions hidrostàtiques

El processament dels aliments per alta pressió hidrostàtica (HHP), també anomenat processament per alta pressió (HPP) o per pressió ultra elevada (UHP), és una tecnologia emergent que resulta molt interessant com a alternativa als processos tèrmics de conservació. Consisteix en sotmetre als aliments a pressions compreses entre 100 i 1000 MPa, les quals provoquen la destrucció i/o la inactivació dels microorganismes patògens i/o deteriorants, la modificació de biomolècules i la inactivació o activació enzimàtica. Les condicions d’aplicació dels tractaments HHP solen ser de 0ºC fins a 100ºC de temperatura, durant intervals de temps que oscil·len des de polsos de pocs segons fins a tractaments de més de 20 minuts de durada.

Els efectes dels tractaments HHP es basen en diferents principis físics (Cheftel, 1992; Heremans, 1992, a: Tewari et al., 2001; Knorr, 1993):

a) El principi de Le Chatelier, que estableix que qualsevol fenomen que comporta una disminució del volum es veu afavorit per un increment de pressió i viceversa. Per tant, l’alta pressió afecta a qualsevol fenomen que comporti un canvi de volum i afavoreix els fenòmens que tenen com a resultat una disminució del volum (reaccions químiques, canvis de fase, canvis en la configuració molecular).

b) El principi de Pascal, que indica que la pressió actua isostàticament, és a dir, que es transmet de forma uniforme i quasi instantània a través de tot el producte alimentari, independentment de la seva grandària, volum, geometria, forma i composició, sempre i quan la mostra estigui en contacte directe amb el medi transmissor de la pressió, o hermèticament segellat en un envàs flexible que transmeti la pressió. La presència de gas (aire) a l’interior fa que la transmissió de la pressió no sigui instantània. c) El principi d’ordenació microscòpica, que implica que, a temperatura constant, un increment de la pressió incrementa el grau d’ordenació de les molècules d’un substrat.

Addicionalment, a diferència dels tractaments tèrmics, el temps necessari pels tractaments HHP és independent de la massa i la grandària de les mostres, de manera que permeten reduir el temps de processat (Zimmerman i Bergman, 1993, a: Barbosa- Cánovas et al., 1998) i els requeriments energètics també són menors.

Efectes de l’alta pressió

La conservació dels aliments mitjançant els tractaments HHP està basada en diferents efectes de la pressió sobre els sistemes biològics com per exemple: la permeabilitat i la funcionalitat de la membrana de les cèl·lules, la morfologia cel·lular, les reaccions bioquímiques i els mecanismes genètics dels microorganismes (Hoover et al., 1989; Hoover, 1993). La membrana cel·lular és la part dels microorganismes que es veu afectada en primer terme (Morita, 1975). Aquesta, després de la pressurització, normalment mostra alterada la seva permeabilitat al modificar-se la capa de fosfolípids, fet que provoca des de danys subletals a les cèl·lules supervivents fins a la lisi cel·lular. La morfologia cel·lular també es pot veure afectada a partir de 6 atmosferes, ja que el gas intracel·lular de les vacuoles pot col·lapsar a aquesta pressió (Knorr, 1995). Quant a les reaccions bioquímiques, l’aplicació de pressió afavoreix les reaccions que provoquen una disminució de volum i retarda les que comporten un increment d’aquest. Respecte als mecanismes genètics, la pressió afecta als enzims implicats en la replicació i la transcripció, mentre que els àcids nucleics presenten una gran estabilitat enfront la pressió i són més baroresistents que les proteïnes.

Donat que la pressió no afecta als enllaços covalents, els components de baix pes molecular dels aliments com les vitamines, els colorants i els flavours no es veuen afectats per la pressió i, per tant, el valor nutritiu i les característiques organolèptiques dels productes tractats per HHP es solen mantenir força intactes. Tanmateix, l’alta pressió actua sobre les interaccions no covalents que estabilitzen l’estructura de les molècules biològiques (com els ponts d’hidrogen i les interaccions electrostàtiques i hidrofòbiques) i, com a conseqüència, pot induir canvis conformacionals en les proteïnes i els polisacàrids (midó, pectines, alginats, etc.) com per exemple la desnaturalització i l’agregació proteica o la formació de gels de proteïnes i la gelificació del midó (Van Camp, 1996). També està descrit que l’exposició a alta pressió pot inactivar o activar les reaccions enzimàtiques deteriorants. La inactivació enzimàtica està influenciada pel pH, concentració de substrat, estructura de les subunitats de l’enzim, i la temperatura i el temps de pressurització (Hoover et al., 1989).

Equips d’alta pressió

Actualment el equips industrials d’alta pressió hidrostàtica consisteixen en instal·lacions discontínues d’entre 10 i 500 L de capacitat, per a aliments líquids, fluids viscosos, sòlids o amb ingredients sòlids, o sistemes semicontinus de 1 a 4 t/h de producció, aptes només per a productes líquids.

A la Figura 4.1 es mostra un esquema d’un equip discontinu per al tractament HHP que consta d’una cambra cilíndrica de pressurització (1), una bomba de baixa pressió (2), un intensificador de la pressió (3) que utilitza el líquid des de la bomba de baixa pressió per generar un fluid transmissor d’alta pressió, el medi transmissor de la pressió (4) que sol ser aigua o solucions etanòliques (per si s’ha de treballar a baixes temperatures), i un circuit de refrigeració o calefacció extern (5). El processament HHP es porta a terme normalment mitjançant líquids de baixa compressibilitat, generalment aigua amb un petit percentatge d’oli soluble per lubricar la bomba i per evitar corrosions. La pressió és generada amb una bomba hidràulica i el líquid pressuritzat queda retingut a l’interior de la cambra cilíndrica de tractament de gran espessor i resistència, on es produeix la pressurització del producte (Cheftel, 1992).

El nostre grup de recerca ha portat a terme diversos estudis dels efectes del processament amb altes pressions hidrostàtiques sobre la contaminació microbiològica i la funcionalitat proteica de la fracció plasmàtica de la sang de porc (Parés, 1998; Parés et al., 1998a; Parés et al., 2000; Parés et al., 2001). A partir d’aquests estudis, es va arribar a la conclusió que l’aplicació de tractaments HHP a 450 MPa durant 15 min a temperatures superiors a 25ºC era un mètode efectiu per millorar la qualitat microbiològica del plasma de porcí. La pressurització realitzada a 40ºC durant 15 min era la que presentava una major efectivitat sobre la reducció dels recomptes microbiològics del plasma. Pel que fa a la funcionalitat, els tractaments realitzats a 450 MPa i a 40ºC produïen una disminució de la solubilitat al pH natural de les proteïnes del plasma (pH 7,4) però milloraven l’activitat emulsionant, l’estabilitat de l’escuma i les propietats funcionals dels gels de plasma obtinguts per escalfament. Per altra banda, els tractaments realitzats en condicions de refrigeració (5ºC) no afectaven la solubilitat ni les propietats de superfície de les proteïnes del plasma.

4.2 OBJECTIUS

Els objectius del present capítol són, en primer terme, posar a punt el tractament d’altes pressions hidrostàtiques per aplicar-lo a la higienització de la fracció cel·lular de la sang de porc. Amb aquesta finalitat, s’avaluaran els efectes del tractament per HHP a diferents condicions de pressió (400, 450 i 500 MPa), temperatura (5, 20 i 40ºC) i temps (5, 15 i 30 min) sobre la qualitat microbiològica, així com sobre algunes característiques funcionals de la FC com la solubilitat proteica, la viscositat i el color.

Un cop fixades les millors condicions de pressió, temperatura i temps d’aplicació del tractament HHP a la FC, es determinaran les propietats funcionals de la FC higienitzada per altes pressions hidrostàtiques i deshidratada per atomització. Concretament, s’avaluaran l’activitat emulsionant, la capacitat escumant i de formació de pastes per escalfament, així com la textura i la capacitat de retenció d’aigua de les pastes obtingudes a partir de la FC sotmesa als dos processos tecnològics. S’ha plantejat estudiar la funcionalitat de la FC sotmesa a una pressurització i posteriorment conservada mitjançant la deshidratació per atomització, donat que la forma viable d’una possible industrialització i utilització de la fracció cel·lular seria com un producte en pols.

4.3 MATERIAL I MÈTODES

4.3.1 Procedència de les mostres

Es van utilitzar mostres de sang de porc recollides del tanc d’emmagatzematge en refrigeració d’un escorxador industrial de característiques descrites al capítol 2 (apartat 2.3.2). Les mostres de fracció cel·lular hemolitzada es van obtenir segons el procediment descrit a l’apartat 2.3.3 del capítol 2. Tots els experiments es van realitzar amb mostres de sang recollides en diferents dies però en les mateixes condicions. Les mostres de fracció cel·lular hemolitzada sempre es van pressuritzar el dia següent d’haver recollit la sang i es mantenien en refrigeració en ampolles de vidre estèrils fins al moment del tractament d’higienització.

4.3.2 Tractament amb altes pressions hidrostàtiques

Els tractaments de HHP es van realitzar en una premsa isostàtica discontínua (Alstom, Nantes, França) situada al Centre Especial de Recerca-Planta de Tecnologia dels Aliments de la Facultat de Veterinària de la Universitat Autònoma de Barcelona, que disposa d’una cambra de pressurització de 2 L de capacitat, de 10 cm de diàmetre i 25 cm d’alçada. Es van utilitzar bosses de plàstic PA/PE flexibles de 250 x 500 mm (Cryovac Packaging Spain S.L., Barcelona), en les quals es van introduir uns 250 mL de FC hemolitzada (Figura 4.2). Les bosses es tancaven intentant no deixar bombolles d’aire a l’interior ja que aquestes disminueixen l’eficàcia del tractament, s’introduïen en una altra bossa de les mateixes característiques i es termosegellaven al buit. Les diverses condicions dels tractaments HHP aplicades foren 400, 450 i 500 MPa, a 5, 20 i 40ºC durant 5, 15 i 30 minuts.

Aquest equip permet aplicar pressions de fins a 500 MPa; la pressió s’assoleix en un període de temps d’entre 1 i 2 minuts i, al final del cicle, la descompressió s’aconsegueix en 40-90 segons. La durada dels períodes de compressió i descompressió sempre era la mateixa en tots els tractaments. La temperatura de l’aigua a l’interior de la cambra de pressurització era mesurada amb una termosonda per controlar si es produïen variacions de la temperatura durant els tractaments. La temperatura màxima assolida durant els tractaments va ser d’uns 2ºC per sobre de la temperatura programada.

La temperatura de tractament s’assolia mitjançant el bescanvi de calor a través de la doble camisa de la cambra de pressurització, per on es feia circular aigua provinent d’un bany en els tractaments realitzats a 20 i 40ºC, o bé una barreja d’etanol i aigua (3:1), com a fluid refrigerant, en els tractaments realitzats a temperatures de refrigeració (5ºC), per evitar la possible cristal·lització de l’aigua durant el període de descompressió. El líquid transmissor de la pressió a l’interior de la cambra era una emulsió d’oli en aigua (10 % d’oli) per a mantenir la bomba lubricada. Es va utilitzar un oli soluble Dromus Oil B (Shell Espanya, Madrid). Les mostres que s’havien de tractar a 20 i 40ºC, un cop envasades, es deixaven a temperatura ambient, i les que s’havien de tractar a 5ºC es mantenien en refrigeració fins al moment del tractament.  Les mostres no tractades i totes les mostres després dels tractaments HHP es van  mantenir a 5ºC fins que es realitzaven les anàlisis corresponents i aquest temps oscil·lava entre 2 i 4 hores.

4.3.3 Contaminació microbiològica

Per avaluar l’efecte de l’aplicació de l’alta pressió hidrostàtica sobre la qualitat microbiològica de la FC de la sang de porc es va determinar la capacitat de reducció de la contaminació general per part del tractament d’higienització i la capacitat de creixement de la població supervivent després del tractament. Les anàlisis microbiològiques es realitzaven el mateix dia en què les mostres es sotmetien als tractaments d’alta pressió.

4.3.3.1 Recompte de microorganismes aerobis mesòfils

Per avaluar la capacitat de reducció de la contaminació microbiològica de la FC per part del tractament HHP es van determinar els recomptes dels microorganismes aerobis mesòfils en les mostres no tractades i en les mostres pressuritzades. Les determinacions microbiològiques es van fer pel mètode de la sembra en massa, sembrant 1 mL de les dilucions corresponents en el medi de cultiu de recompte general no selectiu Base Agar Sang (Oxoid Ltd.) descrit al capítol 2 (apartat 2.2.5.1). Les plaques s’incubaven en una estufa de cultiu a 37 ± 1ºC durant 24 hores i posteriorment es realitzava el recompte de les colònies crescudes.

4.3.3.2 Capacitat de creixement de la microbiota contaminant

Per avaluar de forma més acurada la capacitat d’higienització de les altes pressions sobre la FC es va determinar l’efecte del tractament HHP sobre el creixement de la població microbiana després de la pressurització. D’aquesta manera es podia avaluar la capacitat de creixement dels microorganismes supervivents als diferents tractaments HHP, donat que alguns microorganismes poden ser danyats o inhibits per les altes pressions, però en condicions favorables es poden recuperar. Aquests microorganismes probablement no creixen en el medi de cultiu Base Agar Sang i, per aquest motiu, es va avaluar l’evolució de la microbiota contaminat a la FC higienitzada pel tractament HHP respecte la de les mostres control.

L’evolució de la càrrega microbiològica contaminat de la FC higienitzada per alta pressió i de la FC no tractada es va determinar mitjançant un mètode turbidimètric. La turbidimetria és un mètode ràpid per a la detecció i el recompte de microorganismes, basat en mesures de la densitat òptica que representen el desenvolupament de la població bacteriana en temps real, donat que quan els microorganismes creixen i es multipliquen en un medi líquid fan augmentar la seva terbolesa, de manera que l’absorbància serà proporcional a la concentració de microorganismes.

Es va utilitzar un analitzador microbiològic turbidimètric Bioscreen C (Labsystems Corporation, Helsinki, Finlàndia) que és un espectrefotòmetre que permet processar lectures verticals d’un gran nombre de mostres líquides disposades en plaques multipouets. Les corbes de creixement de la microbiota supervivent es van obtenir mesurant les variacions de l’absorbància a 600 nm cada 20 minuts, sobre alíquotes de 200 mL d’una dilució 1/200 de FC en Brou Nutritiu M.5 (Oxoid Ltd.), de les mostres incubades a 31ºC durant 132 hores. Es van utilitzar plaques de 100 pouets i es realitzaren quatre repeticions per a cadascuna de les mostres estudiades per obtenir les corbes de creixement mitjanes de la població. La capacitat de creixement dels microorganismes supervivents de la FC es va avaluar comparant la velocitat de creixement (que es va calcular a partir dels pendents de la fase de creixement exponencial linearitzada mitjançant la transformació en logaritmes neperians) i el temps de generació (calculat com el Ln 2/pendents) de la microbiota supervivent a les mostres pressuritzades i a les no tractades.

4.3.4 Color CIE L*a*b*

Per avaluar l’efecte de les altes pressions sobre el color de la FC es van determinar els canvis produïts sobre els paràmetres CIE L*a*b* del color. Donat que la FC és un fluid opac, la determinació de les coordenades cromàtiques es va realitzar amb un colorímetre Minolta CR-300 amb un conus de projecció de vidre segons la metodologia descrita a l’apartat 2.2.6.2. Es van dur a terme tres mesures dels paràmetres CIE L*a*b* sobre cada mostra.

4.3.5 Solubilitat proteica

Es determinà la solubilitat proteica a pH neutre (7) i a pH àcid (4,5) de la FC, com el percentatge de proteïna soluble respecte el percentatge de proteïna total segons el mètode de Morr et al. (1985).

M.5 : Brou Nutritiu (NB, Oxoid CM 1) composició (g·L-1)

pH: 7,4 ± 0,2 Pols “Lab-Lemco” 1,0

Extracte de llevat 2,0

Peptona 5,0

Clorur sòdic 5,0

Capítol 4 115

La determinació de la solubilitat de cada mostra es va fer per duplicat, en solucions de FC al 4 % (p/v), una es va ajustar a pH 4,5 i l’altra a pH 7, segons el mateix procediment descrit a l’apartat 2.2.4.2. Cada determinació es va fer individualment per duplicat sobre cada mostra.

4.3.6 Viscositat

Per determinar la viscositat es va utilitzar un viscosímetre-reòmetre rotacional de cilindres concèntrics Bohlin Visco 88 BV (Bohlin Instruments Ltd., Cirencester, Anglaterra). Les mesures de viscositat es realitzaren amb 15 mL de les mostres FC que prèviament havien estat temperades a 25ºC. Donat que la FC presentava una viscositat intermèdia (entre 70 i 600 mPa·s) es va utilitzar com a sistema de mesura la combinació d’èmbol mòbil (cilindre rotacional intern) i cilindre fix (extern) de 25 mm i 27 mm de diàmetre, respectivament. Es va treballar a una velocitat de rotació de 327 rpm (5,45 Hz) i es comprovava que el sistema de mesura i la velocitat rotacional permetessin que el parell de torsió sempre estigués comprès entre 0,5 i 9,5 mN·m. La viscositat es va mesurar en Pascal*segons amb un gradient de deformació o cisalla (shear rate) de 384 s-1 i es van prendre quatre mesures consecutives de cada mostra.

4.3.7 Determinació de les propietats funcionals

Per determinar les propietats funcionals de la FC higienitzada per altes pressions hidrostàtiques es va dissenyar un experiment aleatoritzat per blocs complets. Aquest experiment es va dur a terme sobre 5 mostres de FC hemolitzada (5 repeticions) provinents de sang de porc, obtingudes en diferents dies però en les mateixes condicions. Cada mostra es va dividir en dos alíquotes d’uns 500 mL que es va envasar en ampolles flexibles de PE de baixa densitat (Bibby Sterilin Ltd., Anglaterra) sense deixar gens d’espai de cap. Una alíquota es va utilitzar com a control (FC no tractada) i l’altra es va sotmetre al tractament d’higienització amb HHP segons les millors condicions d’operació (Toldrà et al., 2002) que es descriuen en la primera part d’aquest capítol. Ambdues mostres es van mantenir en refrigeració fins al moment de la deshidratació. Les mostres de FC es van deshidratar per atomització en un equip de laboratori Büchi Mini Spray Dryer B-191 (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Suïssa) a les següents condicions: temperatura d’entrada de l’aire de 140ºC; cabal d’alimentació constant de 670 mL·h-1; cabal d’aire d’aspiració de 60 L·h-1; i 5 bar de pressió pel flux d’aire per a la polvorització. Les temperatures de sortida de l’aire mitjanes assolides durant el procés de deshidratació de les diferents mostres es mostren a la Taula 4.1. Les mostres de FC es van assecar el mateix dia que s’havien sotmès al tractament HHP.

Donat que l’aplicació del tractament HHP a la FC produïa un increment de la viscositat del producte, per tal de facilitar el procés de polvorització de la FC pressuritzada i evitar l’obturació del broquet nebulitzador, es va fer una dilució en aigua per disminuir la seva viscositat. La FC pressuritzada es va deshidratar a una concentració d’extracte sec del 30 %, mentre que l’extracte sec de la FC control era del 35 %.

A la Taula 4.1 es mostren els continguts en humitat de les mostres de FC control i FC tractada per HHP després de la deshidratació per atomització a 140ºC. La repetició número 3 es va deshidratar sota unes condicions d’elevada humitat relativa ambiental, les quals van disminuir la capacitat de deshidratació de l’equip i, com a conseqüència, aquesta mostra presentava un major % d’humitat i una menor Tª de sortida de l’aire. Tanmateix, el 5,27 % d’humitat d’aquesta mostra coincideix amb el valor assolit en les mostres de FC deshidratades amb l’altre equip de deshidratació per atomització utilitzat als experiments del capítol 2, el qual es corresponia a un contingut en aigua inferior al de la capa monomolecular. Per aquest motiu, no es va descartar aquesta repetició. El contingut en humitat de la FC control en pols era del 3,5 ± 0,7 % i el de la FC pressuritzada en pols del 3,23 ± 0,8 %; per tant, en ambdós tipus de mostres en pols, malgrat haver diluït una mica la FC tractada per alta pressió, s’assolia un contingut en aigua prou baix com per garantir la correcta conservació dels productes.

Taula 4.1: Percentatges d’humitat (g d’aigua per 100 g de pols) de les 5 mostres de FC no tractades (control) i pressuritzades deshidratades per atomització a 140ºC i temperatures de sortida de l’aire durant la deshidratació.

Humitat (%) Tª sortida aire (ºC) a

Mostra

FC control FC + HHP FC control FC + HHP

Repetició 1 3,18 3,04 80,6 ± 0,9 80,1 ± 2,5

Repetició 2 3,92 3,59 74,8 ± 1,1 73,8 ± 1,7

Repetició 3 5,27 5,21 66,0 ± 3,0 66,5 ± 2,3

Repetició 4 3,03 1,98 77,6 ± 1,4 78,0 ± 2,0

Repetició 5 2,33 2,31 78,3 ± 0,9 78,1 ± 0,8

a Mitjanes ± IC, n=8 (P=95%).

Es van determinar els efectes del tractament HHP i de la deshidratació per atomització sobre les propietats funcionals més interessants de la FC, comparant la funcionalitat de la FC pressuritzada i deshidratada amb la de la FC no tractada deshidratada. Les propietats funcionals estudiades van ser: la solubilitat proteica, l’activitat emulsionant, la capacitat escumant i l’estabilitat de l’escuma, la capacitat de retenció d’aigua i la textura de les pastes formades per escalfament de solucions de FC.

Paral·lelament a la realització d’aquest experiment, es van investigar els efectes de l’aplicació dels 2 processos tecnològics de conservació, el processament amb altes pressions i la deshidratació posterior, sobre el color i la qualitat microbiològica de la FC. De manera que es van determinar els recomptes de microorganismes aerobis mesòfils de la FC no tractada i la FC higienitzada per HHP, abans i després de la deshidratació per atomització (FC líquida i FC en pols reconstituïda al mateix extracte sec que la líquida, per descartar l’efecte de la concentració dels microorganismes al producte assecat), segons el procediment descrit a l’apartat 2.2.5.1. Els paràmetres CIE L*a*b* del color de la FC pressuritzada i la FC no tractada deshidratades per atomització es van determinar tal com s’ha descrit a l’apartat 2.2.6.2.

© 2005 Transgalactic Ltd (manufacturer of Bioscreen C software) | Privacy Statement | P.O. Box 1393, 00101 Helsinki, Finland, phone: +358 9 85172920, fax: +358 9 8749481, e-mail: microbiology@bionewsonline.com
 

Last modified: May 25, 2005