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Scientific Publications - Work Done by Microbiology Reader
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Fakultät für Biologie der Universität Bielefeld, 2004, 130 pp [Untersuchung von Proteinen mit „Resuscitation-Promoting Factor“-Motiv und der für sie kodierenden Gene in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032](Ger.) Michael Hartmann
Bielefeld im März 2004 INHALTSVERZEICHNIS I ZUSAMMENFASSUNG 1 II EINLEITUNG 2 1 Taxonomische Einordnung von Corynebakterien 2 2 Wirtschaftliche Bedeutung 3 3 Molekulargenetische Methoden für Corynebacterium glutamicum 4 4 Stammentwicklung im Zeitalter der Postgenomik 5 5 Bakterielle Wachstumsfaktoren 6 6 Der resuscitation-promoting factor (Rpf) aus Micrococcus luteus 7 7 M. tuberculosis-Zellen synthetisieren fünf Proteine mit Rpf-Motiv 12 8 Ziele dieser Arbeit 14 III MATERIAL UND METHODEN 15
1 Verwendete Bakterienstämme, Plasmide und Primer 15 1.1 Bakterienstämme 15 1.2 Plasmide 16 1.3 Primer 17 2 Medien 18 2.1 Nährmedien 18 2.2 Zusätze zu Nährmedien 19 3 Puffer und Lösungen 19 3.1 Lösungen und Puffer für DNA-Isolierung, -Reinigung und -Bearbeitung 19 3.2 Lösungen und Puffer für DNA-Gelelektrophoresen 20 3.3 Lösungen für DNA-Transfer 21 3.4 Lösungen und Puffer für PCR-Reaktionen 21 3.5 Lösungen und Puffer zur Darstellung von RNA in denaturierenden Agarosegelen 21 3.6 Puffer zur Aufreinigung Poly-His-markierter Proteine mittels magnetischer Ni-NTA Agarosepartikel 22 3.7 Lösungen und Puffer für SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresen 22 3.8 Lösungen und Puffer für Proteinfärbungen 23 3.9 Lösungen und Puffer für tryptischen Proteinverdau und MALDI-TOF MS 24 3.10 Lösungen und Puffer für Semi-Dry-Blot / Western Blot 24 4 Enzyme, Chemikalien, Materialien, Geräte und Software 25 4.1 Enzyme, Antikörper und Längenstandards 25 4.2 Chemikalien 26 4.3 Materialien 28 4.4 Kits 29 4.5 Geräte 29 4.6. Software zur Gerätesteuerung und Datenanalyse 30 5 Kultivierung von Bakterien 31 5.1 Bakterienanzucht auf Festmedien und in Flüssigkultur 31 5.2 Lagerung von Bakterien 31 5.3 Bestimmung des Bakterientiters 31 6 Isolierung von DNA 31 6.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit 31 6.2 Plasmid-DNA-Isolierung aus C. glutamicum 32 6.3 Isolierung chromosomaler DNA aus C. glutamicum 33 7 Reinigung von DNA 34 7.1 Sephadex-Gelfiltration 34 7.2 Bestimmung der DNA-Konzentration 34 8 DNA-Analysen 34 8.1 Agarose-Gelelektrophorese 34 8.2 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 35 9 Klonierungsexperimente 36 9.1 DNA-Restriktion 36 9.2 Erzeugung von blunt ends 36 9.3 5’-Dephosphorylierung gespaltener DNA 36 9.4 Ligation von DNA 36 10 DNA-Transfer 37 10.1 Elektrotransformation von E. coli 37 10.2 Elektrotransformation von C. glutamicum 38 11 Polymerase-Kettenreaktion 39 11.1 PCR-Primerdesign 40 11.2 PCR-Reaktion 40 11.3 Aufreinigung von PCR-Amplifikaten 40 12 Klonierung von PCR-Amplifikaten 41 13 Gendeletion durch die „GeneSOEing“-Methodik 42 13.1 PCR-Schnelltest zum Nachweis von Integrationen und Deletionen im 43 Chromosom von C. glutamicum 14 Auswertung von DNA- und Aminosäuresequenzen 44 15 RNA-Isolierung 44 15.1 Gesamt-RNA-Isolierung aus C. glutamicum-Zellen 44 15.2 RNA-Reinigung und DNase-Behandlung 45 15.3 Bestimmung von RNA-Reinheit und Konzentration 46 15.4 Elektrophoretische Auftrennung von Gesamt-RNA in denaturierenden 46 Agarose-Gelen 15.5 PCR-basierter Test auf DNA-Freiheit von RNA-Proben 47 16 Transkriptionsmessungen mit dem LightCycler 47 17 Extraktion von Proteinen 48 17.1 Herstellung von cytosolischen Proteinrohextrakten 48 17.2 Isolierung und Konzentration von Proteinen aus Überständen bakterieller 49 Kulturen 17.3 Aufreinigung Poly-His-markierter Proteine aus komplexen Gemischen 50 17.4 Bestimmung des Proteingehalts 51
18 Trennung und Visualisierung von Proteinen 51 18.1 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 51 18.2 Zweidimensionale Gelelektrophorese 53 18.3 Proteinfärbung mit Coomassie Brilliant Blue 54 18.4 Colloidale Proteinfärbung mit Coomassie G-250 55 19 Nachweis von Proteinen: Immunoblotting (Western Blot) 55 19.1 Semi-Dry-Proteinblot 55 19.2 Ponceau-Färbung 56 19.3 Immunologische Detektion geblotteter Proteine 56 20 Lokalisierung von Proteinen durch Immunofluoreszenzmikroskopie 56 21 Proteinidentifizierung durch peptide mass fingerprints 57 21.1 Tryptischer Verdau 57 21.2 MALDI-TOF-Massenspektrometrie 58 21.3 Auswertung von peptide mass fingerprints mittels MASCOT 59 22 Detektion von Glykoproteinen 60 23 Bestimmung der Kohlenhydratzusammensetzung von Glykopro‑ teinen durch GC/MS 61 23.1 Hydrolyse und Derivatisierung von Glykoproteinen 61 23.2 Gaschromatographie 61 23.3 Massenspektrometrie 61 23.4 Auswertung der Chromatogramme 62 IV ERGEBNISSE 63 1 Das Genom von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 besitzt zwei Gene, rpf1 und rpf2, die für Proteine mit resuscitation‑ promoting factor-Motiven kodieren 63 2 In vivo-Expression des rpf1- und rpf2-Gens in C. glutamicum 68 3 Konstruktion von C. glutamicum-Mutanten, die Deletionen innerhalb der rpf-Gene tragen bzw. eines der Gene verstärkt exprimieren 70 4 Überstände von C. glutamicum-Kulturen enthalten verschiedene Formen des Rpf2-Proteins 71 5 Das Rpf2-Protein aus C. glutamicum wird durch Glykosylierung modifiziert 77 6 Mannose und Galaktose sind zwei Hauptbestandteile des Kohlenhydratanteils des Rpf2-Glykoproteins aus C. glutamicum 78 7 Das Rpf2-Protein ist auf der Oberfläche von C. glutamicum-Zellen lokalisiert 80 8 Eine gleichzeitige Deletion beider rpf-Gene führt zu beeinträchtigtem Wachstum von C. glutamicum-Zellen nach Transfer eines kleinen Inokulums 81 9 Die gleichzeitige Deletion beider rpf-Gene führt nach Inokulation aus einer langandauernden Stationärphase zu beeinträchtigtem Wachstum..82 10 Der Kulturüberstand logarithmisch wachsender C. glutamicum-Zellen besitzt einen wachstumsfördernden Effekt 83 V DISKUSSION 85
1 C. glutamicum-Zellen synthetisieren zwei Proteine mit Rpf-Motiv 85 2 Das Rpf2-Protein aus C. glutamicum kommt in verschiedenen Formen vor 87 3 Die rpf-Gene sind für C. glutamicum nicht essentiell 89 4 Die gleichzeitige Ausschaltung beider rpf-Gene in C. glutamicum kann zu beeinträchtigtem Wachstum führen 90 5 Der Kulturüberstand logarithmisch wachsender C. glutamicum-Zellen enthält einen wachstumsbeeinflussenden Faktor 92 6 Ein Modell für eine auf mehreren Komponenten basierende inter‑ zelluläre Kommunikation von C. glutamicum 93 VI LITERATURVERZEICHNIS 96 VII ANHANG 102 1 Abbildungverzeichnis 102 2 Tabellenverzeichnis 104 3 Häufig verwendete Abkürzungen 105 4 Ein- und Drei-Buchstaben-Code für Aminosäuren 106 5 Sequenzdaten 107 5.1 Sequenz des rpf1-Gens aus C. glutamicum 107 5.2 Sequenz des rpf2-Gens aus C. glutamicum 108 5.3 Gen- und Mutationskarte des rpf1-Gens aus C. glutamicum 109 5.4 Gen- und Mutationskarte des rpf2-Gens aus C. glutamicum 109
6 Proteine mit Ähnlichkeit zu den Rpf-Proteinen aus C. glutamicum 110 6.1 tBlastN-Abfrage gegen die nr-Datenbank mit der Aminosäuresequenz des Rpf1-Proteins aus C. glutamicum 110 6.2 tBlastN-Abfrage gegen die nr-Datenbank mit der Aminosäuresequenz des Rpf2-Proteins aus C. glutamicum 111 6.3 Rpf-Proteine ausgewähter Actinomycetales 112 6.4 Multiples Alignment von Rpf-Proteinen ausgewählter Actinomycetales 113 6.5 Phylogenetische Einordnung der Rpf-Proteine 115 6.6 Multiples Alignment Rpf2-ähnlicher Proteine 116
7 Plasmidkarten 117 7.1 In dieser Arbeit verwendete Vektoren 117 7.2 Vektorkonstrukte zur Erzeugung definierter Deletionen im Chromosom 118 von C. glutamicum 7.3 Vektorkonstrukte zur verstärkten Expression des rpf1- bzw. rpf2- Gens aus C. glutamicum im homologen System 119
8 Massenspektren 120 8.1 Massenspektren zur Identifizierung von Galaktose als Bestandteil des Kohlenhydratanteils der Rpf2-Glykosylierung 120 8.2 Massenspektren zur Identifizierung von Mannose als Bestandteil des Kohlenhydratanteils der Rpf2-Glykosylierung 121 I ZUSAMMENFASSUNG Durch Analyse der Gesamtgenomsequenz von Corynebacterium glutamicum wurden zwei offene Leseraster, rpf1 und rpf2, identifiziert, deren abgeleitete Aminosäuresequenzen Ähnlichkeiten mit dem essentiellen Resuscitation-promoting factor (Rpf) aus Micrococcus luteus aufweisen. Vorallem ein Bereich von ca. 80 Aminosäuren, das sogenannte Rpf-Motiv, ist bei diesen Proteinen hochkonserviert. Beide rpf-Gene werden in vivo transkribiert und die von ihnen kodierten Proteine von C. glutamicum-Zellen an das umgebende Medium abgegeben. Durch Amplifizierung und Klonierung entsprechender DNA-Bereiche aus C. glutamicum wurden rekombinierte Stämme konstruiert, die jeweils eines der rpf-Gene verstärkt exprimieren bzw. in einem oder beiden Genen definierte Deletionen tragen. Das Rpf1-Protein konnte bei verstärkter Expression seines kodierenden Gens aus dem Überstand von C. glutamicum-Kulturen aufgereinigt werden, während das Rpf2-Protein sowohl im Kulturüberstand als auch auf der Zelloberfäche nachgewiesen wurde. Durch Aufreinigung aus Kulturüberständen und anschließender MALDI-TOF-Massenspektrometrie konnten drei Rpf2-Formen mit molekularen Massen von 35, 42 und 47 kDa sowie mehrere verkürzte Formen des Proteins identifiziert werden. Mit einem Enzym-Immunoassay kombinierte Western-Blot-Analysen zeigten eine Glykosylierung der beiden größeren Rpf2-Formen, die ihre reduzierte Mobilität bei SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresen begründen könnte. Galaktose und Mannose wurden durch kombinierte gaschromatographische und massenspektrometrische Untersuchungen als Hauptbestandteile des Oligosaccharidanteils der Rpf2-Glykosylierung identifiziert. Rekombinante C. glutamicum-Stämme, die definierte Deletionen in einem der beiden rpf-Gene tragen, zeigten im Vergleich zu Kontrollstämmen unter Standardanzuchtbedingungen keine phänotypischen Veränderungen. Allerdings besitzt eine rpf-Doppelmutante von C. glutamicum nach Überimpfung eines kleinen Inokulums eine deutlich verlängerte lag-Phase, wächst im Vergleich zu den Einzelmutanten und dem Kontrollstamm verlangsamt und erreicht am Ende der Kultivierung geringere Zelldichten. Das Wachstum der Doppelmutante ist in ähnlicher Weise beeinträchtig, wenn die Zellen vor Überimpfung in frisches Medium einer langandauernden Stationärphase ausgesetzt waren. Die Zugabe von sterilen Kulturüberständen logarithmisch wachsender C. glutamicum-Kulturen sorgt unter diesen Bedingungen für eine signifikante Reduktion der apparenten lag-Phase aller getesteten Stämme mit Ausnahme der rpf-Doppelmutante. Diese Befunde legen nahe, dass es in C. glutamicum vermutlich ein funktionales Zusammenspiel der Rpf-Proteine mit mindestens einer weiteren wachstumsfördernden Substanz im Kulturüberstand dieser Bakterien gibt, welches eine Verkürzung der apparenten lag-Phase bewirken kann. II EINLEITUNG 1 Taxonomische Einordnung von Corynebakterien Corynebakterien sind fakultativ anaerobe, nicht-sporulierende und nicht-motile Stäbchen, die eine keulen- oder hantelförmige Zellmorphologie besitzen. Charakteristisch für diese Spezies ist ein lichtmikroskopisch sichtbares Abwinkeln der Zellen, bedingt durch eine asymmetrische Auftrennung der Zellwand während der Zellteilung (snapping division). Die Zellwandzusammensetzung aus dem Polymer Arabinogalaktan und kurzkettigen Mycolsäuren von 22 bis 36 Kohlenstoffatomen Länge sowie der Aufbau des Peptidoglykans auf der Basis von meso-Diaminopimelinsäure (Collins et al., 1982) sind weitere wichtige taxonomische Merkmale.
Abbildung II.01: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von C. glutamicum-Zellen. Die keulenförmige Morphologie und die Ausbildung der snapping division (Pfeil) sind deutlich zu erkennen. Aufgrund chemotaxonomischer Studien konnte unter Berücksichtigung des Zellwandaufbaus, der Peptidoglykanstruktur, dem Vorkommen von Mycolsäuren und der Lipidzusammensetzung eine enge phylogenetische Verwandtschaft von Corynebakterien mit den Gattungen Mycobacterium, Nocardia und Rhodococcus nachgewiesen werden. Nach Barksdale (1970) werden diese vier Gattungen deshalb in der CMN-Gruppe zusammengefasst. Mit einem G+C-Gehalt zwischen 46 und 74 mol% (Funke et al., 1995) gehören Corynebakterien der großen Gruppe hoch-G+C-haltiger Gram-positiver Bakterien an, welche die Actinomyceten-Unterfamilie der Eubakterien bildet (Stackebrandt und Woese, 1981). In dieser Sektion werden vorwiegend human- und tierpathogene Stämme, aber auch einige apathogene Spezies der Boden-, Wasser- und Hautflora taxonomisch erfasst. Pflanzenpathogene Vertreter wurden inzwischen zumeist in den Gattungen Curtobacterium bzw. Clavibacter reklassifiziert (Collins et al., 1982; Davis et al., 1984; Jones und Collins, 1986). Die Gattung Corynebacterium (griech.: Koryne = Keule) wurde ursprünglich 1896 von Lehmann und Neumann zur Klassifizierung der medizinisch bedeutsamen Spezies Corynebacterium diphtheriae definiert. Heute werden Corynebakterien in Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Vol. 2, 1986) als Genus „Corynebacterium Lehmann and Neumann 1896“ der Sektion 15 „Irregular, nonsporing Gram-positive rods“ zugeordnet (Collins und Cummins, 1986). 2 Wirtschaftliche Bedeutung Durch ihr breites Spektrum unterschiedlicher Stoffwechselleistungen erlangten Corynebakterien nicht nur wissenschaftliches, sondern auch wirtschaftliches Interesse. So werden heute hauptsächlich bodenbewohnende, apathogene Vertreter dieser Gruppe zur Produktion und Umsetzung einer Vielzahl von Stoffen eingesetzt (Tab. II.01). Bereits 1957 wurden Corynebakterien als Aminosäureproduzenten entdeckt (Kinoshita et al., 1957). Damals konnte gezeigt werden, dass Kulturüberstände von Corynebacterium glutamicum (ehemals Micrococcus glutamicus) große Mengen der Aminosäure L-Glutamat enthalten. Seitdem wurden für verschiedene Aminosäuren, die sowohl in der Industrie und als auch in medizinischen Bereichen Anwendung finden, fermentative Herstellungsverfahren unter Verwendung von coryneformen Bakterien entwickelt (Leuchtenberger, 1996). Tab. II.01: Industrielle Einsatzgebiete coryneformer Bakterien.
Besondere industrielle Bedeutung erlangte das Bodenbakterium C. glutamicum durch seinen Einsatz bei der fermentativen Gewinnung von essentiellen Aminosäuren und Vitaminen, die in der Landwirtschaft als Supplemente zur ernährungsphysiologischen Aufwertung von Futtermitteln dienen, darunter insbesondere L-Lysin und L-Threonin (Leuchtenberger, 1984; Pühler und Kalinowski, 1995; Kircher und Leuchtenberger, 1998). In einem jährlich für die meisten Aminosäuren um mehr als 10% wachsenden Markt werden heute insgesamt mehr als zwei Millionen Tonnen an Aminosäuren, zumeist durch Bioprozesse mit coryneformen Bakterien, hergestellt. Im Jahre 2002 wurden mit optimierten C. glutamicum-Stämmen ca. 1,5 Millionen t L-Glutamat und 550.000 t L-Lysin produziert (Hermann, 2003). Der Bedarf an Aminosäuren nimmt weiterhin ständig zu, da sie außer als Tierfutteradditive auch als Geschmacksverstärker (Natrium-L-Glutamat), kalorienarmer Süßstoff (L-Aspartyl-L-Phenylalanin-Methylester, Aspartam) und Antioxidationsmittel (LCystein, L-Histidin, L-Tryptophan) in der Lebensmittelindustrie sowie als Rohstoff für die Produktion von Kosmetika und Infusionslösungen zur postoperativen Therapie verwendet werden (Hoppe und Martens, 1983). Mittlerweile stellen fermentativ produzierte Aminosäuren bezüglich Volumen und Marktwert die wichtigsten biotechnologischen Produkte dar (Ikeda 2003). 3 Molekulargenetische Methoden für Corynebacterium glutamicum Aufgrund der vielfältigen Einsatzmöglichkeiten coryneformer Bakterien bei industriellen Prozessen war die Entwicklung gentechnischer Methoden von entscheidender Bedeutung für die Konstruktion und Leistungssteigerung geeigneter Produktionsstämme (Pühler und Kalinowski, 1995). Zunächst erfolgte die Stammentwicklung durch ein iteratives System aus ungerichteter chemischer Mutagenese und anschließender Selektion auf eine Überproduktion des gewünschten Produktes (Rowlands, 1984). Allerdings ist bei dieser Methode eine molekulargenetische Charakterisierung der entstehenden Mutanten kaum möglich. Zudem treten häufig Mehrfachmutationen auf, deren Einfluss auf den gesuchten Phänotyp nicht abzuschätzen ist (Ohnishi et al., 2002) und die daher eine rationale Stammentwicklung erschweren. Aus diesem Grund kamen in den vergangenen Jahren zunehmend neuentwickelte molekulargenetische Methoden zur gezielten Manipulation der Synthesewege und ihrer Regulationsmechanismen zum Einsatz. Mit den rekombinanten DNA-Techniken ist die Stammentwicklung damit nun hauptsächlich auf rationales metabolic engineering ausgerichtet. Die genetische Manipulation von Corynebakterien basiert dabei im wesentlichen auf Vektoren, die von den kryptischen Plasmiden pBL1 aus Brevibacterium lactofermentum (Santamaria et al., 1984) und pHM1519 aus C. glutamicum (Miwa et al., 1985) abgeleitet sind. Ausgehend von diesen Systemen wurden sowohl Escherichia coli-C. glutamicum shuttle-Vektoren (Martin, 1989; Wohlleben et al., 1993, Kirchner und Tauch, 2003), Expressions- und Integrationsvektoren (Kirchner und Tauch, 2003; Schäfer et al., 1994) als auch Promotor- und Terminator-Testvektoren (Morinaga et al., 1987; Cardenas et al., 1991; Eikmanns et al., 1991; Bardonnet und Blanco, 1991; Schwarzer und Pühler, 1991; Sonnen et al., 1991; Deb und Nath, 1999) entwickelt. Durch den Einsatz des sacB-Gens aus Bacillus subtilis, welches in C. glutamicum Saccharose-Sensitivität verleiht (Jäger et al., 1992; 1995; Schäfer et al., 1994), lassen sich darüber hinaus positiv selektionierbare, definierte Deletionsmutanten konstruieren, die zur molekulargenetischen Analyse von Stoffwechsel-wegen einsetzbar sind. Durch Optimierung von Konjugations- und Elektroporationstechniken (Bonassie et al., 1991; Haynes und Britz, 1989; Kirchner und Tauch, 2003; Schäfer et al., 1990; Tauch et al., 2002) stehen inzwischen auch effiziente Methoden für den DNA-Transfer nach Corynebakterien zur Verfügung. 4 Stammentwicklung im Zeitalter der Postgenomik Eine weitere grundlegende Veränderung erfuhr die Stammentwicklung von bakteriellen Aminosäureproduzenten durch die Sequenzierung und Annotation kompletter Genome. Die vollständige Nukleotidsequenz von C. glutamicum ATCC 13032 wurde durch zwei voneinander unabhängige Genomprojekte (Ikeda und Nakagawa, 2003; Kalinowski et al., 2003) entschlüsselt. Ebenso sind die Genome von C. efficiens, einer sehr nahe mit C. glutamicum verwandten Spezies (Fudou et al., 2002), C. diphtheriae und einiger verwandter Mycobacterien und Streptomyceten in öffentlichen Datenbanken zugänglich. Neben dem Vorteil, dass nun sämtliche Gene des Kohlenstoffflusses von der Substrataufnahme bis zur Sekretion eines gewünschten Endproduktes leicht identifiziert werden können und damit einer Manipulation zugänglich sind, bieten vollständige Genomsequenzen darüber hinaus die Möglichkeit zur umfassenden Analyse zellulärer Vorgänge sowohl auf Transkriptom- als auch auf Proteomebene (Loos et al., 2001; Hermann et al., 2001). Eindimensionale Entwicklungsstrategien (z. B. die exklusive Anwendung von Screening-Tech-niken) können nun durch schnellere, hochparallele Vorgehensweisen auf der Grundlage von DNA-Mikroarrays und Techniken der Proteomics, Metabolomics und Fluxomics abgelöst werden (Hermann, 2003). Somit bietet sich die Chance, ein umfassendes Bild der physiologischen Zustände von C. glutamicum-Zellen während der Überproduktion eines gewünschten Stoffes zu erhalten, das mit großer Wahrscheinlichkeit neue Ansatzpunkte für eine weitere Verbesserung von bereits bestehenden Produktionsstämmen liefern kann (Hodgson, 1998). Ein wichtiger Aspekt ist dabei der Vergleich von Phasen optimalen Wachstums mit Phasen optimaler Produktsynthese. So hofft man, regulatorische Netzwerke, die für eine maximale Aminosäureproduktion relevant sind, identifizieren und detailliert untersuchen zu können (Pfefferle et al., 2003). 5 Bakterielle Wachstumsfaktoren Bakterielle wachstumsregulierende Faktoren sind bei der weiteren Verbesserung industriell genutzter Produktionsstämme von besonderem Interesse, stellen sie doch potentielle Ansatzpunkte für eine gesamtphysiologische Ausrichtung von Produktionsstämmen auf möglichst hohe Produktausbeuten in Fermentationen möglichst kurzer Dauer dar. Für Eukaryonten ist seit längerem bekannt, dass bestimmte von den Zellen produzierte Faktoren, die sogenannten Cytokine, bei der Kontrolle, Aktivierung und Regulation komplexer metabolischer Aktivitäten sowie beim Wachstum und der Zellteilung eine herausragende Rolle spielen (Callard und Gearing, 1994). Auch Gewebekulturen höherer, sich differenzierender Zellen benötigen in der Regel komplexe Wachstumsfaktoren, um sich erfolgreich teilen zu können. Die Funktion dieser Cytokine wird generell darin gesehen, an die Zellmembran anderer Zellen zu binden (parakrine Wirkung) und dadurch die Produktion von second messenger-Molekülen (z. B. cGMP) auszulösen. Diese sorgen dann ihrerseits für die Aktivierung verschiedenster, zum Teil sehr komplexer Regulationsnetzwerke, die auch die Steuerung des second messengers selbst beinhalten können (Alberts, 1996). In Gegensatz zu den Erkenntnissen für Eukaryonten wurden bakterielle Zellen lange Zeit als „autonom“ angesehen. Sie wachsen und teilen sich scheinbar unabhängig von der Anwesenheit weiterer Zellen oder exogener Faktoren (Kaprelyants und Kell, 1996; Kell und Young, 2000). Tatsächlich scheint eine einzelne Bakterienzelle unter geeigneten Bedingungen (Temperatur, pH-Wert, Verfügbarkeit von Nährstoffen, Vitaminen, Spurenelementen etc.) in der Lage zu sein, in Flüssigmedium eine Trübung hervorzurufen bzw. auf Festmedium eine Kolonie auszubilden. Dieses Phänomen wird als „autonomes Wachstum“ bezeichnet (Kaprelyants und Kell, 1996). Im Gegensatz zu dieser konventionellen Sichtweise mehren sich in jüngerer Zeit jedoch Hinweise für eine weitreichende Beteiligung von chemischen Signalstoffen bei der interzellulären Kommunikation zwischen bakteriellen Zellen (Swift et al., 1994; Kell et al., 1995; Dunny und Leonhard, 1997; Kleerebezem et al., 1997). Diese spielt insbesondere bei spezifischen zellulären Ereignissen, etwa der Sporulation und der Ausbildung von Kompetenz bei Bacillus subtilis (Kaiser und Losick, 1993; Lazazzera und Grossann, 1998) der Konjugation zwischen Enterococcen (Clewell,1993), der Regulation von Pathogenitätsfaktoren bei Pseudomonas aeruginosa und verschiedenen Erwinia-Spezies sowie der Biolumineszenz bei Vibrio fischeri (Greenberg et al., 1996) eine sehr bedeutsame Rolle. Es kann also festgestellt werden, dass eine Vielzahl verschiedener, von Bakterien produzierter Sekundärmetabolite bei der Initiation und Regulation zellulärer Differenzierungen bei Prokaryonten beteiligt ist (Stephens, 1986). Ähnliche Mechanismen der Signalweiterleitung zwischen bakteriellen Zellen könnten demnach auch generell für die Zellteilung in wachsenden Bakterienkulturen von Bedeutung sein (Kaprelyants und Kell, 1996). 6 Der resuscitation-promoting factor (Rpf) aus Micrococcus luteus Ein Beispiel für ein Signalmolekül, das bakterielles Wachstum beeinflußt, wurde mit dem resuscitation-promoting factor (Rpf) aus Micrococcus luteus veröffentlicht (Mukamolova et al., 1998). Nach Kultivierung bis zur Stationärphase und anschließender Fortführung der Inkubation im aufgezehrten Nährmedium können Zellen des Gram-positiven, nicht sporulierenden Bakteriums M. luteus in einen „schlafenden“ Zustand (dormant state) übergehen, in dem sie über mehrere Monate hinweg weiter existieren können (Abb.III.02).
Abb.II.02: Modell zur Darstellung des Übergangs aktiv wachsender Bakterienzellen in einen „schlafenden“- Zustand (dormant state) während einer ausgedehnten Stationärphase. Die Farbintensität der Pfeile gibt die Stoffwechselaktivität der Bakterienzellen wieder. Der Ausdruck „Nonculturable“ ist in diesem Zusammenhang gleichbedeutend mit einer Unfähigkeit der Bakterien, auf geeignetem Festmedium Kolonien auszubilden. (Shleeva et al., 2002) In diesem Zustand zeigen die Zellen nur eine äußerst geringe Stoffwechselaktivität und sind zum größten Teil temporär nicht kultivierbar. Während in logarithmisch wachsenden Kulturen die Zahl kultivierbarer Zellen annähernd 100 % beträgt, abgeschätzt durch den Vergleich von colony forming units (cfu) auf Agarplatten und der optisch bestimmten Gesamtzellzahl, liegt der Anteil kultivierbarer Zellen in Kulturen mit M. luteus-Zellen im dormant state unter 0,01 % (Kaprelyants und Kell, 1993). Wird zu einer derartigen Kultur allerdings steril filtrierter Überstand aus einer M. luteus-Kultur, die sich in der spät logarithmischen Wachstumsphase befindet, zugegeben, ist eine „Wiederbelebung“ (resuscitation) der Zellen feststellbar. Die Zahl der cfu nimmt sehr stark zu und erreicht annähernd den Wert der Gesamtzellzahl. Diese und weitere Experimente zeigten, dass logarithmisch wachsende M. luteus-Zellen einen Pheromon-ähnlichen, hitzeempfindlichen, nicht dialysierbaren und Trypsin-sensitiven Stoff produzieren, der die resuscitation von Zellen im dormant state hervorruft (Votyakova et al., 1994). Im Jahre 1998 gelang schließlich die Aufreinigung eines ca. 16-17 kDa großen Proteins aus dem Überstand einer logarithmisch wachsenden M. luteus-Kultur, das eine Aktivität als resuscitation-promoting factor (Rpf) zeigte (Mukamolova et al., 1998). Das Protein verlor seine biologische Aktivität nach Erwärmung über 100°C und nach Trypsinbehandlung. Außerdem wurden die aktiven Biomoleküle von einem 12 kDa cut-off Filter zurückgehalten. Aufgereinigtes Rpf war bereits in picomolarer Konzentration in der Lage, den Anteil lebender Zellen einer Kultur im dormant state um einen Faktor von ca. 100 zu erhöhen (Mukamolova et al., 1998).
Abb.II.03: Resuscitation-Aktivität verschiedener Fraktionen einer Proteinaufreinigung aus dem Kulturüberstand logarithmisch wachsender M. luteus-Zellen. Die Proteine des Kulturüberstands wurden durch Gelfiltration mit einer DEAE-Sepharose- und einer Mono Q-Säule aus dem Kultur-überstand isoliert. 200 µl Lactatminimalmedium mit 2 µl der jeweiligen Fraktion wurden mit gehungerten M. luteus-Zellen (cfu: 3 × 106 × ml-1; Gesamtzellzahl: 5 × 109 × ml-1) inokuliert. Die Kulturen wurden 120 h in einem Bioscreen C optical growth analyser inkubiert. Die optische Dichte wurde dabei automatisiert einmal pro Stunde bestimmt und die Anzahl lebender Zellen durch die most probable number-Methodik (MPN) anhand publizierter Tabellen berechnet (nach Mukamolova et al., 1998). Das Rpf-Protein wurde N-terminal ansequenziert und anhand der erhaltene Aminosäuresequenz wurden Primer synthetisiert, die zur Amplifizierung eines Teils des rpf-Gens aus M. luteus benutzt wurden. Durch Southern-Hybridisierungen dieser Genprobe gegen eine Genbank von M. luteus konnte schließlich das 660 bp große rpf-Gen identifiziert und vollständig sequenziert werden (Mukamolova et al., 1998). Das von ihm abgeleitete Genprodukt besitzt N-terminal ein 38 Aminosäuren umfassendes putatives Leaderpeptid, wie es für exkretierte Proteine Gram-positiver Bakterien typisch ist (Nielsen et al., 1997). Für das prozessierte Rpf-Protein wurde eine molekulare Masse von 19,15 kDa berechnet, die damit gößer als die elektrophoretisch bestimmte apparente Masse von 16-17 kDa ist. Vergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Rpf-Proteins aus M. luteus mit Sequenzdatenbanken zeigten bereits zum damaligen Zeitpunkt eine hohe Ähnlichkeit des N-terminalen Bereichs des prozessierten Rpf-Moleküls mit fünf Kodierbereichen aus dem Genom von Mycobacterium tuberculosis und zwei weiteren Proteinen aus Mycobacterium leprae. Weitere Analysen der Aminosäuresequenz des Rpf-Proteins aus M. luteus zeigten später, dass es zudem am C-Terminus ein LysM-Modul besitzt (Mukamolova et al., 2002a). Für eine derartige Proteindomäne wird angenommen, dass sie eine Bindung an das Peptidoglycan der Zellhülle vermitteln kann (Bateman und Bycroft, 2000). Southern-Hybridisierungen bzw. PCR-Experimente mit vom rpf-Gen abgeleiteten Primern deuteten ferner darauf hin, dass rpf-ähnliche Gene unter den Gram-positiven Bakterien mit hohem G+C-Gehalt weit verbreitet sein könnten. Positive Resultate wurden u. a. für verschiedene Mycobakterien und Streptomyceten sowie für C. glutamicum erhalten. In anderen vollständig sequenzierten Organismen konnten rpf-ähnliche Gene hingegen nicht aufgefunden werden. Mit der steigenden Zahl vollständig sequenzierter Organismen und der damit verbundenen größeren Menge an öffentlich zugänglichen Proteinsequenzen wurde in den nachfolgenden Jahren deutlich, dass die Ähnlichkeit anderer Proteine zu Rpf aus M. luteus vor allem auf einem ca. 80 Aminosäuren umfassenden Bereich basiert, der hoch konserviert ist. Mittlerweile sind über 30 Proteine, die über diesen als Rpf-Motiv bezeichneten konservierten Bereich verfügen und auschließlich aus Organismen der Ordnung der Actinomycetales stammen, bekannt (Mukamolova et al., 2002a). Transkriptionelle Analysen zeigten, dass das rpf-Gen aus M. luteus als monocistronisches Transkript abgelesen wird. Im M. luteus-Genom liegt es hinter einem Kodierbereich für ein Protein, das hohe Ähnlichkeit mit der Transposase des Insertions-elements IS1557 aus M. tuberculosis aufweist. Direkt downstream des rpf-Gens besitzt das M. luteus-Chromosom eine stem-loop-Struktur, welche vermutlich den Transkriptionsterminator des rpf-Gens darstellt. Gefolgt wird dieser DNA-Bereich von zwei Kodierbereichen auf dem Gegenstrang, deren abgeleitete Proteinsequenzen hohe Ähnlichkeiten zu ArgR und ArgF aus verschiedenen Mycobakterien, Streptomyceten und Corynebakterien aufweisen (Mukamolova et al., 2002a). Durch RT-PCR-Reaktionen mit mRNA-Proben, die während eines vollständigen Wachstumsverlaufs von M. luteus-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten isoliert wurden, konnte gezeigt werden, dass rpf-Transkripte bereits 1 h nach Inokulation in frisches Medium in den Zellen vorhanden waren. Die Transkriptmenge des rpf-Gens blieb während der lag-Phase konstant, während sie im Laufe des logarithmischen Wachstums substantiell abnahm. Dauerte die anschließende Stationärphase längere Zeit an, so konnten keine rpf-Transkripte mehr nachgewiesen werden (Mukamolova et al., 2002a). Durch Rpfspezifische ELISA-Tests mit Kulturüberständen von M. luteus-Zellen wurde das Rpf-Protein bereits 5 h nach Inokulation, also zu einem Zeitpunkt als erst zwei Zellteilungen vollzogen waren, nachgewiesen. Es akkumulierte während des logarithmischen Wachstums und nahm in seiner Konzentration anschließend ab. Wurden M. luteus-Zellen mit einem Rpfspezifischen und entsprechend markierten Antikörper inkubiert, konnte das Rpf-Protein durch konfokale Mikroskopie auch auf der Oberfläche der M. luteus-Zellen nachgewiesen werden. Die Autoren sehen hierin den Grund für die zeitliche Differenz zwischen Auftreten des rpf-Tanskripts und dem Vorhandensein des Rpf-Proteins im Kulturüberstand. Sie postulieren, dass das Rpf-Protein zunächst auf der Zelloberfläche lokalisiert ist, sich erst nachfolgend von ihr ablöst und folglich im Kulturüberstand nachgewiesen werden kann (Mukamolova et al., 2002a).
Abb.II.04: Einfluß des Rpf-Proteins aus M. luteus auf das Wachstum von M. luteus-Zellen in einer Succinatminimalmedium-Kultur (SMM) bei Inkubation im Schüttelkolben. Die Zellen wurden in BrothEMedium bis zum Ende des logarithmischen Wachstums angezogen, gewaschen und in SMM resuspendiert. Kolben mit 20 ml SMM wurden mit ca. 1000 Zellen pro ml inokuliert. Das Wachstum wurde durch die Bestimmung der Zahl an lebenden Zellen pro ml in zu unterschiedlichen Zeitpunkten aus der Kultur entnommenen Aliquots verfolgt. Der Versuch wurde in SMM-Medium mit (•) und ohne (O) Zusatz von Rpf (in einer Verdünnung von 1:1000) durchgeführt (nach Mukamolova et al., 1999).
In umfassenden Wachstumsanalysen konnte ein Einfluß des Rpf-Proteins auf das Wachstum von M. luteus-Zellen unter einer ganzen Reihe von experimentellen Bedingungen nachgewiesen werden. So fördert das Rpf-Protein die „Wiederbelebung“ von M. luteus-Zellen im dormant state, verkürzt die lag-Phase neu inokulierter Kulturen in Succinatminimalmedium (Abb.IV.04) und scheint für das Wachstum intensiv gewaschener M. luteus-Zellen bei Überimpfung in flüssiges Lactatminimalmedium unabdingbar zu sein (Mukamolova et al., 1998; 1999). Da das Rpf-Protein bereits in picomolaren Konzentrationen wirksam ist, kann eine Rolle als Nährstoff ausgeschlossen werden (Mukamolova et al., 1998). In weiteren Versuchen konnte durch Zugabe eines aufgereinigten, spezifischen Rpf-Antikörpers das Wachstum von M. luteus vollständig unterbunden werden. Wurde der Kultur bei Inokulation von M. luteus-Zellen in Lactat-Minimalmedium aufgereinigter Rpf-Antikörper in einer Verdünnung von 1:10.000 zugesetzt, konnten die Zellen nur dann Anwachsen, wenn zusätzlich auch Rpf in ausreichender Menge zugesetzt wurde (Mukamolova et al., 2002a). Dieser Befund, der eine generelle Notwendigkeit des Rpf-Proteins für das Wachstum von M. luteus-Zellen nahelegt, konnte durch genetische Methoden bestätigt werden. Mukamolova et al. (2002a) konnten in Mutationsstudien zeigen, dass das singuläre rpf-Gen im Chromosom von M. luteus nur dann inaktiviert werden kann, wenn gleichzeitig eine funktionale plasmidkodierte Kopie des Gens in den entsprechenden Stamm eingebracht wird. Es ist somit davon auszugehen, dass rpf ein essentielles Gen für M. luteus darstellt. Aufgereinigtes Rpf-Protein von M. luteus stimuliert darüber hinaus das Wachstum sowohl schnell wie auch langsam wachsender Mycobakterien (Mukamolova et al., 1998). In Versuchen mit gewaschenen M. smegmatis-Zellen verkürzte es die lag-Phase von mehr als 6 Tagen auf 20-24 Stunden und auch für M. tuberculosis, M. bovis und M. avium war eine lag-Phasen-verkürzende Wirkung feststellbar. Die experimentellen Befunde bezüglich des rpf-Gens aus M. luteus und des von ihm kodierten Rpf-Proteins sind in Abbildung II.05 zusammenfassend dargestellt.
Abb.II.05: Zusammenfassende graphische Darstellung der experimentellen Befunde für das rpf-Gen aus M. luteus und das von ihm kodierte Rpf-Protein. 7 Mycobacterium tuberculosis-Zellen synthetisieren fünf Proteine mit Rpf-Motiv In Untersuchungen mit M. tuberculosis (Sun et al., 1999) und R. rhodocrous (Shleeva et al., 2002), einem langsam bzw. schnellwachsenden Vertreter der Actinomycetales, wurden ebenfalls wachstumsfördernde Effekte für Kulturüberstände bestimmter Wachstumsphasen festgestellt, wobei allerdings zunächst keine genauere Charakterisierung der effektauslösenden Substanz(en) möglich war. Im vollständig sequenzierten Genom von M. bovis und M. tuberculosis wurden aber fünf Gene annotiert (rpfA – rpfE), die für Proteine mit ähnlichen Charakteristika und Eigenschaften wie das Rpf-Protein aus M. luteus kodieren (Mukamolova et al., 2002b). Sie stimulieren ebenfalls bereits in picomolarer Konzentration das Zellwachstum, verfügen alle über das hochkonservierte Rpf-Motiv und weisen ein putatives Leaderpeptid auf, welches nahelegt, dass die Proteine ihre Funktion von einem Ort ausserhalb der Zelle ausüben. Die fünf Rpf-Proteine aus M. tuberculosis fördern über die eigene Spezies hinausgehend auch das Wachstum von M. luteus-, M. smegmatis- und M. bovis- Zellen. Werden diese Stämme mit geringer Zelldichte in Minimal-Flüssigmedium inokuliert, reduzieren aufgereinigte Rpf-Proteine aus M. tuberculosis die apparente lag-Phase signifikant (Mukamolova et al., 2002b). Interessanterweise reagieren aktiv wachsende M. bovis Zellen nicht auf die Zugabe der Rpf-Proteine, während Zellen dieses Organismus, die einer verlängerten Stationärphase ausgesetzt waren, eine deutliche Reaktion zeigen. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der fünf Rpf-Proteine aus M. tuberculosis unter-einander offenbarte, dass sie abgesehen von dem hochkonservierten Rpf-Motiv und einem für exkretierte Proteine aus Gram-positiven Bakterien typischen Leader-Peptid nur wenig Gemeinsamkeiten aufweisen. Zwei von ihnen (RpfA und RpfB) sind vergleichsweise große Proteine. Im Falle von RpfA (Rv0867c, 407 Aminosäuren) ist das Rpf-Motiv N-terminal lokalisiert. Ihm folgt im zentralen Bereich des Proteins eine ausgedehnte Serie prolin- und alaninreicher Wiederholungen der Konsensussequenz APADLAPP. Das RpfB-Protein (Rv1009, 362 Aminosäuren) trägt das Rpf-Motiv dagegen am C-Terminus. Wahrscheinlich ist das RpfB-Protein N-terminal über eine membrane lipoprotein lipid attachment site an die äußere Zelloberfläche von M. tuberculosis gebunden. Die weiteren Rpf-Proteine (RpfC, Rv1884c, 176 Aminosäuren; RpfD, Rv2389c, 154 Aminosäuren; RpfE, Rv2450c, 172aa) sind deutlich kleiner und tragen mit Ausnahme von RpfE das Rpf-Motiv am N-Terminus ihrer prozessierten Formen (Mukamolova et al., 2002b). RT-PCR-Experimente mit aus M. tuberculosis und M. bovis isolierter mRNA zeigten, dass alle fünf rpf-Gene dieser Organismen in aktiv wachsenden Zellen transkribiert werden. In sich nicht teilenden Zellen, die z. B. aus einer bereits längere Zeit andauernden Stationärphase stammten, waren hingegen keine rpf-Transkripte nachweisbar (Mukamolova et al., 2002b). Obwohl keines der rpf-ähnlichen Gene aus M. tuberculosis für sich betrachtet essentiell zu sein scheint und eine Mutation eines dieser Gene keinen Einfluß auf das Wachstum der resultierenden Mutanten besitzt (Sassetti et al., 2003; Tufariello et al., 2004), konnte durch die beschriebenen experimentellen Befunde dennoch gezeigt werden, dass die betreffenden Proteine zum Rpf-Protein aus M. luteus sehr ähnliche Eigenschaften besitzen (Mukamolova et al., 2002b). Aufgrund dieser funktionellen Charakterisierung wurden die fünf M. tuberculosis-Proteine gemeinsam mit Rpf aus M. luteus und anderen Rpf-ähnlichen Proteinen in einer neuen Gruppe bakterieller Wachstumsfaktoren zusammengefasst (Mukamolova et al., 2002b). Die im Zusammenhang mit den Rpf-Proteinen aus M. tuberculosis und der für sie kodierenden rpf-Gene erhaltenen experimentellen Befunde sind in Abbildung II.06 zusammenfassend dargestellt.
Abb.II.06: Zusammenfassende graphische Darstellung der experimentellen Befunde für die Rpf-Proteine aus M. tuberculosis und der für sie kodierenden Gene. 8 Ziel dieser Arbeit
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung für C. glutamicum bedeutsamer Wachstumsfaktoren. Ausgehend von der Genomsequenz für C. glutamicum ATCC 13032 und den aus M. luteus, M. tuberculosis und M. bovis bekannten Genen für Proteine mit resuscitation-promoting factor-Aktivität sollten C. glutamicum-Gene identifiziert werden, die potentiell für Wachstumsfaktoren kodieren könnten. Durch Mutation der im Rahmen dieser Fragestellung gefundenen Gene sollte der Einfluß ihrer Proteine auf das Wachstum von C. glutamicum untersucht werden. Durch proteinanalytische Methoden sollten darüber hinaus Informationen über Struktur, Funktion und Wirkmechanismen der entsprechenden Proteine erhalten werden. III MATERIAL UND METHODEN 1 Verwendete Bakterienstämme, Plasmide und Primer 1.1 Bakterienstämme Tab. III.01: In dieser Arbeit verwendete Bakterienstämme. Stamm Genotyp, relevante Eigenschaften Referenz Escherichia coli F- supE44 endA thi-1- recA1 gyrA96 relA1 deoR (ΔlacZYA-argF) Grant et al., U196 80lacZ m15 mcrA (mrr hsdRMS mcrBC) 1990 F- mcrA (Δmrr hsdRMS ΔmcrBC) 80lacZ m15 lacX74 deoR TOP 10 recA1 araD139 (Δara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 Invitrogen nupG Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Wildtyp RES167 ~ (cglM-cglR-cglIR); restriktionsdefekte Mutante von ATCC Tauch et al., 13032 2002 MH22 RES167 mit Plasmid pMH30 zur Überexpression von rpf1 Diese Arbeit MH23 RES167 mit Plasmid pMH31 zur Überexpression von rpf2 RES167 mit Plasmid pMH32 zur Überexpression eines His-tag markierten rpf1-Gens RES167 mit Plasmid pMH33 zur Überexpression eines His-tag markierten rpf2-Gens RES167-Derivat, das eine 579bp-Deletion innerhalb des rpf1-Gens trägt RES167-Derivat, das eine 1113bp-Deletion innerhalb des rpf2-Gens trägt RES167-Derivat mit definierten Deletionen innerhalb des rpf1-und rpf2-Gens DH5a MCR ATCC MH24 MH25 MH26 MH27 MH28 Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit 1.2 Plasmide Tab.III.02: In dieser Arbeit verwendete Plasmide. (Plasmidkarten einzelner Konstrukte sind im Anhang enthalten (s. Anhang VII.7). Plasmid relevante Eigenschaften Referenz mobilisierbarer E. coli-Vektor, KmR, mcs, lacZ~α sacB E. coli-C. glutamicum shuttle-Expressionsvektor, KmR, Promotor Ptac, mcs, oriE.c. von pACYC177, oriC.g. von pHM1519 T-Überhang-Vektor zur Klonierung von A-Überhang-PCRProdukten, ApR, KmR, mcs, lacZα Vektor zur Klonierung von blunt-end-PCR-Produkten, KmR, ZeoR, mcs, lacZα, ccdB pK18mobsacB mit einem 1.40-kb Fragment, das eine deletierte Version des rpf1-Gens trägt pK18mobsacB mit einem 1.46-kb Fragment, das eine deletierte Version des rpf2-Gens trägt pZ8-1 mit rpf1-Gen stromabwärts des Ptac-Promoters pZ8-1 mit rpf2-Gen stromabwärts des Ptac-Promoters pZ8-1 mit am rpf1-Gen 3’-fusioniertem His-tag stromabwärts des Ptac-Promoters pZ8-1 mit am rpf2-Gen 3’-fusioniertem His-tag stromabwärts des Ptac-Promoters pK18mobsacB pZ8-1 pCR2.1 pCR-Blunt-II pMH22 pMH24 pMH30 pMH31 pMH32 pMH33 Schäfer et al., 1994 Dusch et al., 1999 Invitrogen Invitrogen Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit 1.3 Primer Tab. III.03: In dieser Arbeit verwendete PCR-Primer. Name Sequenz 5’-3’ a rpf1del1 rpf1del2 rpf1del3 rpf2del1 rpf2del2 rpf2del3 rpf1ex1 rpf1ex2 rpf2ex1 rpf2ex2 rpf1his rpf2his rpf1LC1 rpf1LC2 rpf2LC1 rpf2LC2 TACCGCTGCGGCCAAGTCAA TAGCCGACGAAAGCGTTGTATTGTCGCCGTCGAGGTTAGC CACGGCCTCCAACACACCAA CGAATTGTGTGGCCATTG CTATCGGATGCCCAAAAACTTCTTCGCTCTCGG AGCATCAATGATCGGCCA GATCTAGAATTCAAAGGAGGACAACCATGAGAGGAAAACTTTTCATG GATCTAGGATCCCTAGCCGACGAAAGCGTTGTA GATCTAGAATTCAAAGGAGGACAACCTTGTTAATTCCCCCGAGAGC GATCTAGGATCCCTATCGGATGCCCAAGCTTG GATCTAGGATCCCTAGTGATGGTGATGGTGATGGCCGACGAAAGCGTTGTA GATCTAGGATCCCTAGTGATGGTGATGGTGATGTCGGATGCCCAAGCTTGC TAACGGCTACCACGGTGGTC GGTTGGAGCGGAGTTCAGTC TTGGCAGCTCAGAACGTACA AGCTGGAGCTTCTGGATCAT Primerpaare zur Analyse der rpf2-Genregion cl1 cl2 cl3 cl4 cl5 cl6 cl7 cl8 cl9 cl10 GGATGGCTGTGGAGGATGTT; TTGGCAGCTCAGAACGTACA; ACAGACCTGGCTCGCATACG; TGCCGTACAACGTCTCTGTC; GCCGCTGATATTGATCCAAC; GACACATTGCTGGAGGTTGC, GGCCAGGTGTACGCTGCTTA; AGAAGACCTCACCTGGCGTT; CGCGCAGTGCAGGAAGAACA; CGATTAATGCTGCGGCGTAG; GTGACTCCGCCGATAAGCAA AGCTGGAGCTTCTGGATCAT CCACCGCAGTTACTGAAGCA CTTCACGCTAGGCACACCAT CCGCTTAACCAACGCATCCA AATACCTCAGGCGTGGACAG GTCAGCGACGGTGTCGTCAT GGTCTAGGTCATCGAGTTCC GCGAGCCATTGGTCCGACAT GCGAGTGGATCATCATCACC a Restriktionsschnittstellen in 5’-Extensionen der Primer sind fett gedruckt. Eingefügte artifizielle C. glutamicum Ribosomenbindestellen sind unterstrichen. 2 Medien Sofern nicht anders angegeben beziehen sich alle Angaben auf ein Endvolumen von einem Liter. 2.1 Nährmedien LB Vollmedium (Luria Bertani, Sambrook et al., 1989) – 10 g Trypton – 5 g Hefe-Extrakt – 5 g NaCl – 2 g Glukose-Monohydrat (bei Bedarf) pH 7,2 PA Vollmedium (Penassay Broth) – 17,5 g Antibiotic Medium No. 3 SOC Medium – 20 g Trypton – 5 g Hefe-Extrakt – 0,60 g Natriumchlorid (NaCl) – 0,18 g Kaliumchlorid (KCl) – 2,04 g Magnesiumchlorid (MgCl2 • 6 H2O) – 2,46 g Magnesiumsulfat (MgSO4 • 7 H2O) – 4 g Glukose-Monohydrat Minimalmedium MM1 (nach Katsumata et al., 1984, jedoch ohne Hefeextrakt) – 10 g Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) – 3 g Harnstoff – 1 g Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) – 0,4 g Magnesiumsulfat (MgSO4 • 7 H2O) – 1 ml Spurenelementlösung SE-MM1 in 900 ml H2O lösen, autoklavieren, anschließend zugeben: – 2,5 ml Thiamin (0,2 mg/ml), sterifiltriert – 250 µl Biotin (0,2 mg/ml), sterilfiltriert mit C-Quelle und H2O bidest. auf 1 l auffüllen Spurenelementlösung SE-MM1 – 0,2 g Eisensulfat (FeSO4 • 7 H2O) – 0,2 g Magnesiumsulfat (MnSO4 • 7 H2O) – 5 g Calciumchlorid (CaCl2) in 100 ml H2O bidest. lösen, autoklavieren BHIS Medium – 37 g Brain Heart Infusion (Merck) – 91 g Sorbitol 2.2 Zusätze zu Nährmedien Agar – 15 g Agar zur Herstellung von Festmedien vor dem Autoklavieren zugeben C-Quellen sämtliche verwendete C-Quellen für Minimalmedien werden als 10% - 50% Stammlösungen in H2O bidest. getrennt autoklaviert Antibiotika Tab. III.04: Zur Primärselektion verwendete Antibiotikakonzentrationen.
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