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Scientific Publications - Work Done by Microbiology Reader
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Fakultät für Biologie der Universität Bielefeld, 2004, 130 pp [Untersuchung von Proteinen mit „Resuscitation-Promoting Factor“-Motiv und der für sie kodierenden Gene in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032](Ger.) Michael Hartmann
Bielefeld im März 2004 INHALTSVERZEICHNIS I ZUSAMMENFASSUNG 1 II EINLEITUNG 2 1 Taxonomische Einordnung von Corynebakterien 2 2 Wirtschaftliche Bedeutung 3 3 Molekulargenetische Methoden für Corynebacterium glutamicum 4 4 Stammentwicklung im Zeitalter der Postgenomik 5 5 Bakterielle Wachstumsfaktoren 6 6 Der resuscitation-promoting factor (Rpf) aus Micrococcus luteus 7 7 M. tuberculosis-Zellen synthetisieren fünf Proteine mit Rpf-Motiv 12 8 Ziele dieser Arbeit 14 III MATERIAL UND METHODEN 15
1 Verwendete Bakterienstämme, Plasmide und Primer 15 1.1 Bakterienstämme 15 1.2 Plasmide 16 1.3 Primer 17 2 Medien 18 2.1 Nährmedien 18 2.2 Zusätze zu Nährmedien 19 3 Puffer und Lösungen 19 3.1 Lösungen und Puffer für DNA-Isolierung, -Reinigung und -Bearbeitung 19 3.2 Lösungen und Puffer für DNA-Gelelektrophoresen 20 3.3 Lösungen für DNA-Transfer 21 3.4 Lösungen und Puffer für PCR-Reaktionen 21 3.5 Lösungen und Puffer zur Darstellung von RNA in denaturierenden Agarosegelen 21 3.6 Puffer zur Aufreinigung Poly-His-markierter Proteine mittels magnetischer Ni-NTA Agarosepartikel 22 3.7 Lösungen und Puffer für SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresen 22 3.8 Lösungen und Puffer für Proteinfärbungen 23 3.9 Lösungen und Puffer für tryptischen Proteinverdau und MALDI-TOF MS 24 3.10 Lösungen und Puffer für Semi-Dry-Blot / Western Blot 24 4 Enzyme, Chemikalien, Materialien, Geräte und Software 25 4.1 Enzyme, Antikörper und Längenstandards 25 4.2 Chemikalien 26 4.3 Materialien 28 4.4 Kits 29 4.5 Geräte 29 4.6. Software zur Gerätesteuerung und Datenanalyse 30 5 Kultivierung von Bakterien 31 5.1 Bakterienanzucht auf Festmedien und in Flüssigkultur 31 5.2 Lagerung von Bakterien 31 5.3 Bestimmung des Bakterientiters 31 6 Isolierung von DNA 31 6.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit 31 6.2 Plasmid-DNA-Isolierung aus C. glutamicum 32 6.3 Isolierung chromosomaler DNA aus C. glutamicum 33 7 Reinigung von DNA 34 7.1 Sephadex-Gelfiltration 34 7.2 Bestimmung der DNA-Konzentration 34 8 DNA-Analysen 34 8.1 Agarose-Gelelektrophorese 34 8.2 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 35 9 Klonierungsexperimente 36 9.1 DNA-Restriktion 36 9.2 Erzeugung von blunt ends 36 9.3 5’-Dephosphorylierung gespaltener DNA 36 9.4 Ligation von DNA 36 10 DNA-Transfer 37 10.1 Elektrotransformation von E. coli 37 10.2 Elektrotransformation von C. glutamicum 38 11 Polymerase-Kettenreaktion 39 11.1 PCR-Primerdesign 40 11.2 PCR-Reaktion 40 11.3 Aufreinigung von PCR-Amplifikaten 40 12 Klonierung von PCR-Amplifikaten 41 13 Gendeletion durch die „GeneSOEing“-Methodik 42 13.1 PCR-Schnelltest zum Nachweis von Integrationen und Deletionen im 43 Chromosom von C. glutamicum 14 Auswertung von DNA- und Aminosäuresequenzen 44 15 RNA-Isolierung 44 15.1 Gesamt-RNA-Isolierung aus C. glutamicum-Zellen 44 15.2 RNA-Reinigung und DNase-Behandlung 45 15.3 Bestimmung von RNA-Reinheit und Konzentration 46 15.4 Elektrophoretische Auftrennung von Gesamt-RNA in denaturierenden 46 Agarose-Gelen 15.5 PCR-basierter Test auf DNA-Freiheit von RNA-Proben 47 16 Transkriptionsmessungen mit dem LightCycler 47 17 Extraktion von Proteinen 48 17.1 Herstellung von cytosolischen Proteinrohextrakten 48 17.2 Isolierung und Konzentration von Proteinen aus Überständen bakterieller 49 Kulturen 17.3 Aufreinigung Poly-His-markierter Proteine aus komplexen Gemischen 50 17.4 Bestimmung des Proteingehalts 51
18 Trennung und Visualisierung von Proteinen 51 18.1 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 51 18.2 Zweidimensionale Gelelektrophorese 53 18.3 Proteinfärbung mit Coomassie Brilliant Blue 54 18.4 Colloidale Proteinfärbung mit Coomassie G-250 55 19 Nachweis von Proteinen: Immunoblotting (Western Blot) 55 19.1 Semi-Dry-Proteinblot 55 19.2 Ponceau-Färbung 56 19.3 Immunologische Detektion geblotteter Proteine 56 20 Lokalisierung von Proteinen durch Immunofluoreszenzmikroskopie 56 21 Proteinidentifizierung durch peptide mass fingerprints 57 21.1 Tryptischer Verdau 57 21.2 MALDI-TOF-Massenspektrometrie 58 21.3 Auswertung von peptide mass fingerprints mittels MASCOT 59 22 Detektion von Glykoproteinen 60 23 Bestimmung der Kohlenhydratzusammensetzung von Glykopro‑ teinen durch GC/MS 61 23.1 Hydrolyse und Derivatisierung von Glykoproteinen 61 23.2 Gaschromatographie 61 23.3 Massenspektrometrie 61 23.4 Auswertung der Chromatogramme 62 IV ERGEBNISSE 63 1 Das Genom von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 besitzt zwei Gene, rpf1 und rpf2, die für Proteine mit resuscitation‑ promoting factor-Motiven kodieren 63 2 In vivo-Expression des rpf1- und rpf2-Gens in C. glutamicum 68 3 Konstruktion von C. glutamicum-Mutanten, die Deletionen innerhalb der rpf-Gene tragen bzw. eines der Gene verstärkt exprimieren 70 4 Überstände von C. glutamicum-Kulturen enthalten verschiedene Formen des Rpf2-Proteins 71 5 Das Rpf2-Protein aus C. glutamicum wird durch Glykosylierung modifiziert 77 6 Mannose und Galaktose sind zwei Hauptbestandteile des Kohlenhydratanteils des Rpf2-Glykoproteins aus C. glutamicum 78 7 Das Rpf2-Protein ist auf der Oberfläche von C. glutamicum-Zellen lokalisiert 80 8 Eine gleichzeitige Deletion beider rpf-Gene führt zu beeinträchtigtem Wachstum von C. glutamicum-Zellen nach Transfer eines kleinen Inokulums 81 9 Die gleichzeitige Deletion beider rpf-Gene führt nach Inokulation aus einer langandauernden Stationärphase zu beeinträchtigtem Wachstum..82 10 Der Kulturüberstand logarithmisch wachsender C. glutamicum-Zellen besitzt einen wachstumsfördernden Effekt 83 V DISKUSSION 85
1 C. glutamicum-Zellen synthetisieren zwei Proteine mit Rpf-Motiv 85 2 Das Rpf2-Protein aus C. glutamicum kommt in verschiedenen Formen vor 87 3 Die rpf-Gene sind für C. glutamicum nicht essentiell 89 4 Die gleichzeitige Ausschaltung beider rpf-Gene in C. glutamicum kann zu beeinträchtigtem Wachstum führen 90 5 Der Kulturüberstand logarithmisch wachsender C. glutamicum-Zellen enthält einen wachstumsbeeinflussenden Faktor 92 6 Ein Modell für eine auf mehreren Komponenten basierende inter‑ zelluläre Kommunikation von C. glutamicum 93 VI LITERATURVERZEICHNIS 96 VII ANHANG 102 1 Abbildungverzeichnis 102 2 Tabellenverzeichnis 104 3 Häufig verwendete Abkürzungen 105 4 Ein- und Drei-Buchstaben-Code für Aminosäuren 106 5 Sequenzdaten 107 5.1 Sequenz des rpf1-Gens aus C. glutamicum 107 5.2 Sequenz des rpf2-Gens aus C. glutamicum 108 5.3 Gen- und Mutationskarte des rpf1-Gens aus C. glutamicum 109 5.4 Gen- und Mutationskarte des rpf2-Gens aus C. glutamicum 109
6 Proteine mit Ähnlichkeit zu den Rpf-Proteinen aus C. glutamicum 110 6.1 tBlastN-Abfrage gegen die nr-Datenbank mit der Aminosäuresequenz des Rpf1-Proteins aus C. glutamicum 110 6.2 tBlastN-Abfrage gegen die nr-Datenbank mit der Aminosäuresequenz des Rpf2-Proteins aus C. glutamicum 111 6.3 Rpf-Proteine ausgewähter Actinomycetales 112 6.4 Multiples Alignment von Rpf-Proteinen ausgewählter Actinomycetales 113 6.5 Phylogenetische Einordnung der Rpf-Proteine 115 6.6 Multiples Alignment Rpf2-ähnlicher Proteine 116
7 Plasmidkarten 117 7.1 In dieser Arbeit verwendete Vektoren 117 7.2 Vektorkonstrukte zur Erzeugung definierter Deletionen im Chromosom 118 von C. glutamicum 7.3 Vektorkonstrukte zur verstärkten Expression des rpf1- bzw. rpf2- Gens aus C. glutamicum im homologen System 119
8 Massenspektren 120 8.1 Massenspektren zur Identifizierung von Galaktose als Bestandteil des Kohlenhydratanteils der Rpf2-Glykosylierung 120 8.2 Massenspektren zur Identifizierung von Mannose als Bestandteil des Kohlenhydratanteils der Rpf2-Glykosylierung 121 I ZUSAMMENFASSUNG Durch Analyse der Gesamtgenomsequenz von Corynebacterium glutamicum wurden zwei offene Leseraster, rpf1 und rpf2, identifiziert, deren abgeleitete Aminosäuresequenzen Ähnlichkeiten mit dem essentiellen Resuscitation-promoting factor (Rpf) aus Micrococcus luteus aufweisen. Vorallem ein Bereich von ca. 80 Aminosäuren, das sogenannte Rpf-Motiv, ist bei diesen Proteinen hochkonserviert. Beide rpf-Gene werden in vivo transkribiert und die von ihnen kodierten Proteine von C. glutamicum-Zellen an das umgebende Medium abgegeben. Durch Amplifizierung und Klonierung entsprechender DNA-Bereiche aus C. glutamicum wurden rekombinierte Stämme konstruiert, die jeweils eines der rpf-Gene verstärkt exprimieren bzw. in einem oder beiden Genen definierte Deletionen tragen. Das Rpf1-Protein konnte bei verstärkter Expression seines kodierenden Gens aus dem Überstand von C. glutamicum-Kulturen aufgereinigt werden, während das Rpf2-Protein sowohl im Kulturüberstand als auch auf der Zelloberfäche nachgewiesen wurde. Durch Aufreinigung aus Kulturüberständen und anschließender MALDI-TOF-Massenspektrometrie konnten drei Rpf2-Formen mit molekularen Massen von 35, 42 und 47 kDa sowie mehrere verkürzte Formen des Proteins identifiziert werden. Mit einem Enzym-Immunoassay kombinierte Western-Blot-Analysen zeigten eine Glykosylierung der beiden größeren Rpf2-Formen, die ihre reduzierte Mobilität bei SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresen begründen könnte. Galaktose und Mannose wurden durch kombinierte gaschromatographische und massenspektrometrische Untersuchungen als Hauptbestandteile des Oligosaccharidanteils der Rpf2-Glykosylierung identifiziert. Rekombinante C. glutamicum-Stämme, die definierte Deletionen in einem der beiden rpf-Gene tragen, zeigten im Vergleich zu Kontrollstämmen unter Standardanzuchtbedingungen keine phänotypischen Veränderungen. Allerdings besitzt eine rpf-Doppelmutante von C. glutamicum nach Überimpfung eines kleinen Inokulums eine deutlich verlängerte lag-Phase, wächst im Vergleich zu den Einzelmutanten und dem Kontrollstamm verlangsamt und erreicht am Ende der Kultivierung geringere Zelldichten. Das Wachstum der Doppelmutante ist in ähnlicher Weise beeinträchtig, wenn die Zellen vor Überimpfung in frisches Medium einer langandauernden Stationärphase ausgesetzt waren. Die Zugabe von sterilen Kulturüberständen logarithmisch wachsender C. glutamicum-Kulturen sorgt unter diesen Bedingungen für eine signifikante Reduktion der apparenten lag-Phase aller getesteten Stämme mit Ausnahme der rpf-Doppelmutante. Diese Befunde legen nahe, dass es in C. glutamicum vermutlich ein funktionales Zusammenspiel der Rpf-Proteine mit mindestens einer weiteren wachstumsfördernden Substanz im Kulturüberstand dieser Bakterien gibt, welches eine Verkürzung der apparenten lag-Phase bewirken kann. II EINLEITUNG 1 Taxonomische Einordnung von Corynebakterien Corynebakterien sind fakultativ anaerobe, nicht-sporulierende und nicht-motile Stäbchen, die eine keulen- oder hantelförmige Zellmorphologie besitzen. Charakteristisch für diese Spezies ist ein lichtmikroskopisch sichtbares Abwinkeln der Zellen, bedingt durch eine asymmetrische Auftrennung der Zellwand während der Zellteilung (snapping division). Die Zellwandzusammensetzung aus dem Polymer Arabinogalaktan und kurzkettigen Mycolsäuren von 22 bis 36 Kohlenstoffatomen Länge sowie der Aufbau des Peptidoglykans auf der Basis von meso-Diaminopimelinsäure (Collins et al., 1982) sind weitere wichtige taxonomische Merkmale.
Abbildung II.01: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von C. glutamicum-Zellen. Die keulenförmige Morphologie und die Ausbildung der snapping division (Pfeil) sind deutlich zu erkennen. Aufgrund chemotaxonomischer Studien konnte unter Berücksichtigung des Zellwandaufbaus, der Peptidoglykanstruktur, dem Vorkommen von Mycolsäuren und der Lipidzusammensetzung eine enge phylogenetische Verwandtschaft von Corynebakterien mit den Gattungen Mycobacterium, Nocardia und Rhodococcus nachgewiesen werden. Nach Barksdale (1970) werden diese vier Gattungen deshalb in der CMN-Gruppe zusammengefasst. Mit einem G+C-Gehalt zwischen 46 und 74 mol% (Funke et al., 1995) gehören Corynebakterien der großen Gruppe hoch-G+C-haltiger Gram-positiver Bakterien an, welche die Actinomyceten-Unterfamilie der Eubakterien bildet (Stackebrandt und Woese, 1981). In dieser Sektion werden vorwiegend human- und tierpathogene Stämme, aber auch einige apathogene Spezies der Boden-, Wasser- und Hautflora taxonomisch erfasst. Pflanzenpathogene Vertreter wurden inzwischen zumeist in den Gattungen Curtobacterium bzw. Clavibacter reklassifiziert (Collins et al., 1982; Davis et al., 1984; Jones und Collins, 1986). Die Gattung Corynebacterium (griech.: Koryne = Keule) wurde ursprünglich 1896 von Lehmann und Neumann zur Klassifizierung der medizinisch bedeutsamen Spezies Corynebacterium diphtheriae definiert. Heute werden Corynebakterien in Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Vol. 2, 1986) als Genus „Corynebacterium Lehmann and Neumann 1896“ der Sektion 15 „Irregular, nonsporing Gram-positive rods“ zugeordnet (Collins und Cummins, 1986). 2 Wirtschaftliche Bedeutung Durch ihr breites Spektrum unterschiedlicher Stoffwechselleistungen erlangten Corynebakterien nicht nur wissenschaftliches, sondern auch wirtschaftliches Interesse. So werden heute hauptsächlich bodenbewohnende, apathogene Vertreter dieser Gruppe zur Produktion und Umsetzung einer Vielzahl von Stoffen eingesetzt (Tab. II.01). Bereits 1957 wurden Corynebakterien als Aminosäureproduzenten entdeckt (Kinoshita et al., 1957). Damals konnte gezeigt werden, dass Kulturüberstände von Corynebacterium glutamicum (ehemals Micrococcus glutamicus) große Mengen der Aminosäure L-Glutamat enthalten. Seitdem wurden für verschiedene Aminosäuren, die sowohl in der Industrie und als auch in medizinischen Bereichen Anwendung finden, fermentative Herstellungsverfahren unter Verwendung von coryneformen Bakterien entwickelt (Leuchtenberger, 1996). Tab. II.01: Industrielle Einsatzgebiete coryneformer Bakterien.
Besondere industrielle Bedeutung erlangte das Bodenbakterium C. glutamicum durch seinen Einsatz bei der fermentativen Gewinnung von essentiellen Aminosäuren und Vitaminen, die in der Landwirtschaft als Supplemente zur ernährungsphysiologischen Aufwertung von Futtermitteln dienen, darunter insbesondere L-Lysin und L-Threonin (Leuchtenberger, 1984; Pühler und Kalinowski, 1995; Kircher und Leuchtenberger, 1998). In einem jährlich für die meisten Aminosäuren um mehr als 10% wachsenden Markt werden heute insgesamt mehr als zwei Millionen Tonnen an Aminosäuren, zumeist durch Bioprozesse mit coryneformen Bakterien, hergestellt. Im Jahre 2002 wurden mit optimierten C. glutamicum-Stämmen ca. 1,5 Millionen t L-Glutamat und 550.000 t L-Lysin produziert (Hermann, 2003). Der Bedarf an Aminosäuren nimmt weiterhin ständig zu, da sie außer als Tierfutteradditive auch als Geschmacksverstärker (Natrium-L-Glutamat), kalorienarmer Süßstoff (L-Aspartyl-L-Phenylalanin-Methylester, Aspartam) und Antioxidationsmittel (LCystein, L-Histidin, L-Tryptophan) in der Lebensmittelindustrie sowie als Rohstoff für die Produktion von Kosmetika und Infusionslösungen zur postoperativen Therapie verwendet werden (Hoppe und Martens, 1983). Mittlerweile stellen fermentativ produzierte Aminosäuren bezüglich Volumen und Marktwert die wichtigsten biotechnologischen Produkte dar (Ikeda 2003). 3 Molekulargenetische Methoden für Corynebacterium glutamicum Aufgrund der vielfältigen Einsatzmöglichkeiten coryneformer Bakterien bei industriellen Prozessen war die Entwicklung gentechnischer Methoden von entscheidender Bedeutung für die Konstruktion und Leistungssteigerung geeigneter Produktionsstämme (Pühler und Kalinowski, 1995). Zunächst erfolgte die Stammentwicklung durch ein iteratives System aus ungerichteter chemischer Mutagenese und anschließender Selektion auf eine Überproduktion des gewünschten Produktes (Rowlands, 1984). Allerdings ist bei dieser Methode eine molekulargenetische Charakterisierung der entstehenden Mutanten kaum möglich. Zudem treten häufig Mehrfachmutationen auf, deren Einfluss auf den gesuchten Phänotyp nicht abzuschätzen ist (Ohnishi et al., 2002) und die daher eine rationale Stammentwicklung erschweren. Aus diesem Grund kamen in den vergangenen Jahren zunehmend neuentwickelte molekulargenetische Methoden zur gezielten Manipulation der Synthesewege und ihrer Regulationsmechanismen zum Einsatz. Mit den rekombinanten DNA-Techniken ist die Stammentwicklung damit nun hauptsächlich auf rationales metabolic engineering ausgerichtet. Die genetische Manipulation von Corynebakterien basiert dabei im wesentlichen auf Vektoren, die von den kryptischen Plasmiden pBL1 aus Brevibacterium lactofermentum (Santamaria et al., 1984) und pHM1519 aus C. glutamicum (Miwa et al., 1985) abgeleitet sind. Ausgehend von diesen Systemen wurden sowohl Escherichia coli-C. glutamicum shuttle-Vektoren (Martin, 1989; Wohlleben et al., 1993, Kirchner und Tauch, 2003), Expressions- und Integrationsvektoren (Kirchner und Tauch, 2003; Schäfer et al., 1994) als auch Promotor- und Terminator-Testvektoren (Morinaga et al., 1987; Cardenas et al., 1991; Eikmanns et al., 1991; Bardonnet und Blanco, 1991; Schwarzer und Pühler, 1991; Sonnen et al., 1991; Deb und Nath, 1999) entwickelt. Durch den Einsatz des sacB-Gens aus Bacillus subtilis, welches in C. glutamicum Saccharose-Sensitivität verleiht (Jäger et al., 1992; 1995; Schäfer et al., 1994), lassen sich darüber hinaus positiv selektionierbare, definierte Deletionsmutanten konstruieren, die zur molekulargenetischen Analyse von Stoffwechsel-wegen einsetzbar sind. Durch Optimierung von Konjugations- und Elektroporationstechniken (Bonassie et al., 1991; Haynes und Britz, 1989; Kirchner und Tauch, 2003; Schäfer et al., 1990; Tauch et al., 2002) stehen inzwischen auch effiziente Methoden für den DNA-Transfer nach Corynebakterien zur Verfügung. 4 Stammentwicklung im Zeitalter der Postgenomik Eine weitere grundlegende Veränderung erfuhr die Stammentwicklung von bakteriellen Aminosäureproduzenten durch die Sequenzierung und Annotation kompletter Genome. Die vollständige Nukleotidsequenz von C. glutamicum ATCC 13032 wurde durch zwei voneinander unabhängige Genomprojekte (Ikeda und Nakagawa, 2003; Kalinowski et al., 2003) entschlüsselt. Ebenso sind die Genome von C. efficiens, einer sehr nahe mit C. glutamicum verwandten Spezies (Fudou et al., 2002), C. diphtheriae und einiger verwandter Mycobacterien und Streptomyceten in öffentlichen Datenbanken zugänglich. Neben dem Vorteil, dass nun sämtliche Gene des Kohlenstoffflusses von der Substrataufnahme bis zur Sekretion eines gewünschten Endproduktes leicht identifiziert werden können und damit einer Manipulation zugänglich sind, bieten vollständige Genomsequenzen darüber hinaus die Möglichkeit zur umfassenden Analyse zellulärer Vorgänge sowohl auf Transkriptom- als auch auf Proteomebene (Loos et al., 2001; Hermann et al., 2001). Eindimensionale Entwicklungsstrategien (z. B. die exklusive Anwendung von Screening-Tech-niken) können nun durch schnellere, hochparallele Vorgehensweisen auf der Grundlage von DNA-Mikroarrays und Techniken der Proteomics, Metabolomics und Fluxomics abgelöst werden (Hermann, 2003). Somit bietet sich die Chance, ein umfassendes Bild der physiologischen Zustände von C. glutamicum-Zellen während der Überproduktion eines gewünschten Stoffes zu erhalten, das mit großer Wahrscheinlichkeit neue Ansatzpunkte für eine weitere Verbesserung von bereits bestehenden Produktionsstämmen liefern kann (Hodgson, 1998). Ein wichtiger Aspekt ist dabei der Vergleich von Phasen optimalen Wachstums mit Phasen optimaler Produktsynthese. So hofft man, regulatorische Netzwerke, die für eine maximale Aminosäureproduktion relevant sind, identifizieren und detailliert untersuchen zu können (Pfefferle et al., 2003). 5 Bakterielle Wachstumsfaktoren Bakterielle wachstumsregulierende Faktoren sind bei der weiteren Verbesserung industriell genutzter Produktionsstämme von besonderem Interesse, stellen sie doch potentielle Ansatzpunkte für eine gesamtphysiologische Ausrichtung von Produktionsstämmen auf möglichst hohe Produktausbeuten in Fermentationen möglichst kurzer Dauer dar. Für Eukaryonten ist seit längerem bekannt, dass bestimmte von den Zellen produzierte Faktoren, die sogenannten Cytokine, bei der Kontrolle, Aktivierung und Regulation komplexer metabolischer Aktivitäten sowie beim Wachstum und der Zellteilung eine herausragende Rolle spielen (Callard und Gearing, 1994). Auch Gewebekulturen höherer, sich differenzierender Zellen benötigen in der Regel komplexe Wachstumsfaktoren, um sich erfolgreich teilen zu können. Die Funktion dieser Cytokine wird generell darin gesehen, an die Zellmembran anderer Zellen zu binden (parakrine Wirkung) und dadurch die Produktion von second messenger-Molekülen (z. B. cGMP) auszulösen. Diese sorgen dann ihrerseits für die Aktivierung verschiedenster, zum Teil sehr komplexer Regulationsnetzwerke, die auch die Steuerung des second messengers selbst beinhalten können (Alberts, 1996). In Gegensatz zu den Erkenntnissen für Eukaryonten wurden bakterielle Zellen lange Zeit als „autonom“ angesehen. Sie wachsen und teilen sich scheinbar unabhängig von der Anwesenheit weiterer Zellen oder exogener Faktoren (Kaprelyants und Kell, 1996; Kell und Young, 2000). Tatsächlich scheint eine einzelne Bakterienzelle unter geeigneten Bedingungen (Temperatur, pH-Wert, Verfügbarkeit von Nährstoffen, Vitaminen, Spurenelementen etc.) in der Lage zu sein, in Flüssigmedium eine Trübung hervorzurufen bzw. auf Festmedium eine Kolonie auszubilden. Dieses Phänomen wird als „autonomes Wachstum“ bezeichnet (Kaprelyants und Kell, 1996). Im Gegensatz zu dieser konventionellen Sichtweise mehren sich in jüngerer Zeit jedoch Hinweise für eine weitreichende Beteiligung von chemischen Signalstoffen bei der interzellulären Kommunikation zwischen bakteriellen Zellen (Swift et al., 1994; Kell et al., 1995; Dunny und Leonhard, 1997; Kleerebezem et al., 1997). Diese spielt insbesondere bei spezifischen zellulären Ereignissen, etwa der Sporulation und der Ausbildung von Kompetenz bei Bacillus subtilis (Kaiser und Losick, 1993; Lazazzera und Grossann, 1998) der Konjugation zwischen Enterococcen (Clewell,1993), der Regulation von Pathogenitätsfaktoren bei Pseudomonas aeruginosa und verschiedenen Erwinia-Spezies sowie der Biolumineszenz bei Vibrio fischeri (Greenberg et al., 1996) eine sehr bedeutsame Rolle. Es kann also festgestellt werden, dass eine Vielzahl verschiedener, von Bakterien produzierter Sekundärmetabolite bei der Initiation und Regulation zellulärer Differenzierungen bei Prokaryonten beteiligt ist (Stephens, 1986). Ähnliche Mechanismen der Signalweiterleitung zwischen bakteriellen Zellen könnten demnach auch generell für die Zellteilung in wachsenden Bakterienkulturen von Bedeutung sein (Kaprelyants und Kell, 1996). 6 Der resuscitation-promoting factor (Rpf) aus Micrococcus luteus Ein Beispiel für ein Signalmolekül, das bakterielles Wachstum beeinflußt, wurde mit dem resuscitation-promoting factor (Rpf) aus Micrococcus luteus veröffentlicht (Mukamolova et al., 1998). Nach Kultivierung bis zur Stationärphase und anschließender Fortführung der Inkubation im aufgezehrten Nährmedium können Zellen des Gram-positiven, nicht sporulierenden Bakteriums M. luteus in einen „schlafenden“ Zustand (dormant state) übergehen, in dem sie über mehrere Monate hinweg weiter existieren können (Abb.III.02).
Abb.II.02: Modell zur Darstellung des Übergangs aktiv wachsender Bakterienzellen in einen „schlafenden“- Zustand (dormant state) während einer ausgedehnten Stationärphase. Die Farbintensität der Pfeile gibt die Stoffwechselaktivität der Bakterienzellen wieder. Der Ausdruck „Nonculturable“ ist in diesem Zusammenhang gleichbedeutend mit einer Unfähigkeit der Bakterien, auf geeignetem Festmedium Kolonien auszubilden. (Shleeva et al., 2002) In diesem Zustand zeigen die Zellen nur eine äußerst geringe Stoffwechselaktivität und sind zum größten Teil temporär nicht kultivierbar. Während in logarithmisch wachsenden Kulturen die Zahl kultivierbarer Zellen annähernd 100 % beträgt, abgeschätzt durch den Vergleich von colony forming units (cfu) auf Agarplatten und der optisch bestimmten Gesamtzellzahl, liegt der Anteil kultivierbarer Zellen in Kulturen mit M. luteus-Zellen im dormant state unter 0,01 % (Kaprelyants und Kell, 1993). Wird zu einer derartigen Kultur allerdings steril filtrierter Überstand aus einer M. luteus-Kultur, die sich in der spät logarithmischen Wachstumsphase befindet, zugegeben, ist eine „Wiederbelebung“ (resuscitation) der Zellen feststellbar. Die Zahl der cfu nimmt sehr stark zu und erreicht annähernd den Wert der Gesamtzellzahl. Diese und weitere Experimente zeigten, dass logarithmisch wachsende M. luteus-Zellen einen Pheromon-ähnlichen, hitzeempfindlichen, nicht dialysierbaren und Trypsin-sensitiven Stoff produzieren, der die resuscitation von Zellen im dormant state hervorruft (Votyakova et al., 1994). Im Jahre 1998 gelang schließlich die Aufreinigung eines ca. 16-17 kDa großen Proteins aus dem Überstand einer logarithmisch wachsenden M. luteus-Kultur, das eine Aktivität als resuscitation-promoting factor (Rpf) zeigte (Mukamolova et al., 1998). Das Protein verlor seine biologische Aktivität nach Erwärmung über 100°C und nach Trypsinbehandlung. Außerdem wurden die aktiven Biomoleküle von einem 12 kDa cut-off Filter zurückgehalten. Aufgereinigtes Rpf war bereits in picomolarer Konzentration in der Lage, den Anteil lebender Zellen einer Kultur im dormant state um einen Faktor von ca. 100 zu erhöhen (Mukamolova et al., 1998).
Abb.II.03: Resuscitation-Aktivität verschiedener Fraktionen einer Proteinaufreinigung aus dem Kulturüberstand logarithmisch wachsender M. luteus-Zellen. Die Proteine des Kulturüberstands wurden durch Gelfiltration mit einer DEAE-Sepharose- und einer Mono Q-Säule aus dem Kultur-überstand isoliert. 200 µl Lactatminimalmedium mit 2 µl der jeweiligen Fraktion wurden mit gehungerten M. luteus-Zellen (cfu: 3 × 106 × ml-1; Gesamtzellzahl: 5 × 109 × ml-1) inokuliert. Die Kulturen wurden 120 h in einem Bioscreen C optical growth analyser inkubiert. Die optische Dichte wurde dabei automatisiert einmal pro Stunde bestimmt und die Anzahl lebender Zellen durch die most probable number-Methodik (MPN) anhand publizierter Tabellen berechnet (nach Mukamolova et al., 1998). Das Rpf-Protein wurde N-terminal ansequenziert und anhand der erhaltene Aminosäuresequenz wurden Primer synthetisiert, die zur Amplifizierung eines Teils des rpf-Gens aus M. luteus benutzt wurden. Durch Southern-Hybridisierungen dieser Genprobe gegen eine Genbank von M. luteus konnte schließlich das 660 bp große rpf-Gen identifiziert und vollständig sequenziert werden (Mukamolova et al., 1998). Das von ihm abgeleitete Genprodukt besitzt N-terminal ein 38 Aminosäuren umfassendes putatives Leaderpeptid, wie es für exkretierte Proteine Gram-positiver Bakterien typisch ist (Nielsen et al., 1997). Für das prozessierte Rpf-Protein wurde eine molekulare Masse von 19,15 kDa berechnet, die damit gößer als die elektrophoretisch bestimmte apparente Masse von 16-17 kDa ist. Vergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Rpf-Proteins aus M. luteus mit Sequenzdatenbanken zeigten bereits zum damaligen Zeitpunkt eine hohe Ähnlichkeit des N-terminalen Bereichs des prozessierten Rpf-Moleküls mit fünf Kodierbereichen aus dem Genom von Mycobacterium tuberculosis und zwei weiteren Proteinen aus Mycobacterium leprae. Weitere Analysen der Aminosäuresequenz des Rpf-Proteins aus M. luteus zeigten später, dass es zudem am C-Terminus ein LysM-Modul besitzt (Mukamolova et al., 2002a). Für eine derartige Proteindomäne wird angenommen, dass sie eine Bindung an das Peptidoglycan der Zellhülle vermitteln kann (Bateman und Bycroft, 2000). Southern-Hybridisierungen bzw. PCR-Experimente mit vom rpf-Gen abgeleiteten Primern deuteten ferner darauf hin, dass rpf-ähnliche Gene unter den Gram-positiven Bakterien mit hohem G+C-Gehalt weit verbreitet sein könnten. Positive Resultate wurden u. a. für verschiedene Mycobakterien und Streptomyceten sowie für C. glutamicum erhalten. In anderen vollständig sequenzierten Organismen konnten rpf-ähnliche Gene hingegen nicht aufgefunden werden. Mit der steigenden Zahl vollständig sequenzierter Organismen und der damit verbundenen größeren Menge an öffentlich zugänglichen Proteinsequenzen wurde in den nachfolgenden Jahren deutlich, dass die Ähnlichkeit anderer Proteine zu Rpf aus M. luteus vor allem auf einem ca. 80 Aminosäuren umfassenden Bereich basiert, der hoch konserviert ist. Mittlerweile sind über 30 Proteine, die über diesen als Rpf-Motiv bezeichneten konservierten Bereich verfügen und auschließlich aus Organismen der Ordnung der Actinomycetales stammen, bekannt (Mukamolova et al., 2002a). Transkriptionelle Analysen zeigten, dass das rpf-Gen aus M. luteus als monocistronisches Transkript abgelesen wird. Im M. luteus-Genom liegt es hinter einem Kodierbereich für ein Protein, das hohe Ähnlichkeit mit der Transposase des Insertions-elements IS1557 aus M. tuberculosis aufweist. Direkt downstream des rpf-Gens besitzt das M. luteus-Chromosom eine stem-loop-Struktur, welche vermutlich den Transkriptionsterminator des rpf-Gens darstellt. Gefolgt wird dieser DNA-Bereich von zwei Kodierbereichen auf dem Gegenstrang, deren abgeleitete Proteinsequenzen hohe Ähnlichkeiten zu ArgR und ArgF aus verschiedenen Mycobakterien, Streptomyceten und Corynebakterien aufweisen (Mukamolova et al., 2002a). Durch RT-PCR-Reaktionen mit mRNA-Proben, die während eines vollständigen Wachstumsverlaufs von M. luteus-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten isoliert wurden, konnte gezeigt werden, dass rpf-Transkripte bereits 1 h nach Inokulation in frisches Medium in den Zellen vorhanden waren. Die Transkriptmenge des rpf-Gens blieb während der lag-Phase konstant, während sie im Laufe des logarithmischen Wachstums substantiell abnahm. Dauerte die anschließende Stationärphase längere Zeit an, so konnten keine rpf-Transkripte mehr nachgewiesen werden (Mukamolova et al., 2002a). Durch Rpfspezifische ELISA-Tests mit Kulturüberständen von M. luteus-Zellen wurde das Rpf-Protein bereits 5 h nach Inokulation, also zu einem Zeitpunkt als erst zwei Zellteilungen vollzogen waren, nachgewiesen. Es akkumulierte während des logarithmischen Wachstums und nahm in seiner Konzentration anschließend ab. Wurden M. luteus-Zellen mit einem Rpfspezifischen und entsprechend markierten Antikörper inkubiert, konnte das Rpf-Protein durch konfokale Mikroskopie auch auf der Oberfläche der M. luteus-Zellen nachgewiesen werden. Die Autoren sehen hierin den Grund für die zeitliche Differenz zwischen Auftreten des rpf-Tanskripts und dem Vorhandensein des Rpf-Proteins im Kulturüberstand. Sie postulieren, dass das Rpf-Protein zunächst auf der Zelloberfläche lokalisiert ist, sich erst nachfolgend von ihr ablöst und folglich im Kulturüberstand nachgewiesen werden kann (Mukamolova et al., 2002a).
Abb.II.04: Einfluß des Rpf-Proteins aus M. luteus auf das Wachstum von M. luteus-Zellen in einer Succinatminimalmedium-Kultur (SMM) bei Inkubation im Schüttelkolben. Die Zellen wurden in BrothEMedium bis zum Ende des logarithmischen Wachstums angezogen, gewaschen und in SMM resuspendiert. Kolben mit 20 ml SMM wurden mit ca. 1000 Zellen pro ml inokuliert. Das Wachstum wurde durch die Bestimmung der Zahl an lebenden Zellen pro ml in zu unterschiedlichen Zeitpunkten aus der Kultur entnommenen Aliquots verfolgt. Der Versuch wurde in SMM-Medium mit (•) und ohne (O) Zusatz von Rpf (in einer Verdünnung von 1:1000) durchgeführt (nach Mukamolova et al., 1999).
In umfassenden Wachstumsanalysen konnte ein Einfluß des Rpf-Proteins auf das Wachstum von M. luteus-Zellen unter einer ganzen Reihe von experimentellen Bedingungen nachgewiesen werden. So fördert das Rpf-Protein die „Wiederbelebung“ von M. luteus-Zellen im dormant state, verkürzt die lag-Phase neu inokulierter Kulturen in Succinatminimalmedium (Abb.IV.04) und scheint für das Wachstum intensiv gewaschener M. luteus-Zellen bei Überimpfung in flüssiges Lactatminimalmedium unabdingbar zu sein (Mukamolova et al., 1998; 1999). Da das Rpf-Protein bereits in picomolaren Konzentrationen wirksam ist, kann eine Rolle als Nährstoff ausgeschlossen werden (Mukamolova et al., 1998). In weiteren Versuchen konnte durch Zugabe eines aufgereinigten, spezifischen Rpf-Antikörpers das Wachstum von M. luteus vollständig unterbunden werden. Wurde der Kultur bei Inokulation von M. luteus-Zellen in Lactat-Minimalmedium aufgereinigter Rpf-Antikörper in einer Verdünnung von 1:10.000 zugesetzt, konnten die Zellen nur dann Anwachsen, wenn zusätzlich auch Rpf in ausreichender Menge zugesetzt wurde (Mukamolova et al., 2002a). Dieser Befund, der eine generelle Notwendigkeit des Rpf-Proteins für das Wachstum von M. luteus-Zellen nahelegt, konnte durch genetische Methoden bestätigt werden. Mukamolova et al. (2002a) konnten in Mutationsstudien zeigen, dass das singuläre rpf-Gen im Chromosom von M. luteus nur dann inaktiviert werden kann, wenn gleichzeitig eine funktionale plasmidkodierte Kopie des Gens in den entsprechenden Stamm eingebracht wird. Es ist somit davon auszugehen, dass rpf ein essentielles Gen für M. luteus darstellt. Aufgereinigtes Rpf-Protein von M. luteus stimuliert darüber hinaus das Wachstum sowohl schnell wie auch langsam wachsender Mycobakterien (Mukamolova et al., 1998). In Versuchen mit gewaschenen M. smegmatis-Zellen verkürzte es die lag-Phase von mehr als 6 Tagen auf 20-24 Stunden und auch für M. tuberculosis, M. bovis und M. avium war eine lag-Phasen-verkürzende Wirkung feststellbar. Die experimentellen Befunde bezüglich des rpf-Gens aus M. luteus und des von ihm kodierten Rpf-Proteins sind in Abbildung II.05 zusammenfassend dargestellt.
Abb.II.05: Zusammenfassende graphische Darstellung der experimentellen Befunde für das rpf-Gen aus M. luteus und das von ihm kodierte Rpf-Protein. 7 Mycobacterium tuberculosis-Zellen synthetisieren fünf Proteine mit Rpf-Motiv In Untersuchungen mit M. tuberculosis (Sun et al., 1999) und R. rhodocrous (Shleeva et al., 2002), einem langsam bzw. schnellwachsenden Vertreter der Actinomycetales, wurden ebenfalls wachstumsfördernde Effekte für Kulturüberstände bestimmter Wachstumsphasen festgestellt, wobei allerdings zunächst keine genauere Charakterisierung der effektauslösenden Substanz(en) möglich war. Im vollständig sequenzierten Genom von M. bovis und M. tuberculosis wurden aber fünf Gene annotiert (rpfA – rpfE), die für Proteine mit ähnlichen Charakteristika und Eigenschaften wie das Rpf-Protein aus M. luteus kodieren (Mukamolova et al., 2002b). Sie stimulieren ebenfalls bereits in picomolarer Konzentration das Zellwachstum, verfügen alle über das hochkonservierte Rpf-Motiv und weisen ein putatives Leaderpeptid auf, welches nahelegt, dass die Proteine ihre Funktion von einem Ort ausserhalb der Zelle ausüben. Die fünf Rpf-Proteine aus M. tuberculosis fördern über die eigene Spezies hinausgehend auch das Wachstum von M. luteus-, M. smegmatis- und M. bovis- Zellen. Werden diese Stämme mit geringer Zelldichte in Minimal-Flüssigmedium inokuliert, reduzieren aufgereinigte Rpf-Proteine aus M. tuberculosis die apparente lag-Phase signifikant (Mukamolova et al., 2002b). Interessanterweise reagieren aktiv wachsende M. bovis Zellen nicht auf die Zugabe der Rpf-Proteine, während Zellen dieses Organismus, die einer verlängerten Stationärphase ausgesetzt waren, eine deutliche Reaktion zeigen. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der fünf Rpf-Proteine aus M. tuberculosis unter-einander offenbarte, dass sie abgesehen von dem hochkonservierten Rpf-Motiv und einem für exkretierte Proteine aus Gram-positiven Bakterien typischen Leader-Peptid nur wenig Gemeinsamkeiten aufweisen. Zwei von ihnen (RpfA und RpfB) sind vergleichsweise große Proteine. Im Falle von RpfA (Rv0867c, 407 Aminosäuren) ist das Rpf-Motiv N-terminal lokalisiert. Ihm folgt im zentralen Bereich des Proteins eine ausgedehnte Serie prolin- und alaninreicher Wiederholungen der Konsensussequenz APADLAPP. Das RpfB-Protein (Rv1009, 362 Aminosäuren) trägt das Rpf-Motiv dagegen am C-Terminus. Wahrscheinlich ist das RpfB-Protein N-terminal über eine membrane lipoprotein lipid attachment site an die äußere Zelloberfläche von M. tuberculosis gebunden. Die weiteren Rpf-Proteine (RpfC, Rv1884c, 176 Aminosäuren; RpfD, Rv2389c, 154 Aminosäuren; RpfE, Rv2450c, 172aa) sind deutlich kleiner und tragen mit Ausnahme von RpfE das Rpf-Motiv am N-Terminus ihrer prozessierten Formen (Mukamolova et al., 2002b). RT-PCR-Experimente mit aus M. tuberculosis und M. bovis isolierter mRNA zeigten, dass alle fünf rpf-Gene dieser Organismen in aktiv wachsenden Zellen transkribiert werden. In sich nicht teilenden Zellen, die z. B. aus einer bereits längere Zeit andauernden Stationärphase stammten, waren hingegen keine rpf-Transkripte nachweisbar (Mukamolova et al., 2002b). Obwohl keines der rpf-ähnlichen Gene aus M. tuberculosis für sich betrachtet essentiell zu sein scheint und eine Mutation eines dieser Gene keinen Einfluß auf das Wachstum der resultierenden Mutanten besitzt (Sassetti et al., 2003; Tufariello et al., 2004), konnte durch die beschriebenen experimentellen Befunde dennoch gezeigt werden, dass die betreffenden Proteine zum Rpf-Protein aus M. luteus sehr ähnliche Eigenschaften besitzen (Mukamolova et al., 2002b). Aufgrund dieser funktionellen Charakterisierung wurden die fünf M. tuberculosis-Proteine gemeinsam mit Rpf aus M. luteus und anderen Rpf-ähnlichen Proteinen in einer neuen Gruppe bakterieller Wachstumsfaktoren zusammengefasst (Mukamolova et al., 2002b). Die im Zusammenhang mit den Rpf-Proteinen aus M. tuberculosis und der für sie kodierenden rpf-Gene erhaltenen experimentellen Befunde sind in Abbildung II.06 zusammenfassend dargestellt.
Abb.II.06: Zusammenfassende graphische Darstellung der experimentellen Befunde für die Rpf-Proteine aus M. tuberculosis und der für sie kodierenden Gene. 8 Ziel dieser Arbeit
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung für C. glutamicum bedeutsamer Wachstumsfaktoren. Ausgehend von der Genomsequenz für C. glutamicum ATCC 13032 und den aus M. luteus, M. tuberculosis und M. bovis bekannten Genen für Proteine mit resuscitation-promoting factor-Aktivität sollten C. glutamicum-Gene identifiziert werden, die potentiell für Wachstumsfaktoren kodieren könnten. Durch Mutation der im Rahmen dieser Fragestellung gefundenen Gene sollte der Einfluß ihrer Proteine auf das Wachstum von C. glutamicum untersucht werden. Durch proteinanalytische Methoden sollten darüber hinaus Informationen über Struktur, Funktion und Wirkmechanismen der entsprechenden Proteine erhalten werden. III MATERIAL UND METHODEN 1 Verwendete Bakterienstämme, Plasmide und Primer 1.1 Bakterienstämme Tab. III.01: In dieser Arbeit verwendete Bakterienstämme. Stamm Genotyp, relevante Eigenschaften Referenz Escherichia coli F- supE44 endA thi-1- recA1 gyrA96 relA1 deoR (ΔlacZYA-argF) Grant et al., U196 80lacZ m15 mcrA (mrr hsdRMS mcrBC) 1990 F- mcrA (Δmrr hsdRMS ΔmcrBC) 80lacZ m15 lacX74 deoR TOP 10 recA1 araD139 (Δara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 Invitrogen nupG Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Wildtyp RES167 ~ (cglM-cglR-cglIR); restriktionsdefekte Mutante von ATCC Tauch et al., 13032 2002 MH22 RES167 mit Plasmid pMH30 zur Überexpression von rpf1 Diese Arbeit MH23 RES167 mit Plasmid pMH31 zur Überexpression von rpf2 RES167 mit Plasmid pMH32 zur Überexpression eines His-tag markierten rpf1-Gens RES167 mit Plasmid pMH33 zur Überexpression eines His-tag markierten rpf2-Gens RES167-Derivat, das eine 579bp-Deletion innerhalb des rpf1-Gens trägt RES167-Derivat, das eine 1113bp-Deletion innerhalb des rpf2-Gens trägt RES167-Derivat mit definierten Deletionen innerhalb des rpf1-und rpf2-Gens DH5a MCR ATCC MH24 MH25 MH26 MH27 MH28 Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit 1.2 Plasmide Tab.III.02: In dieser Arbeit verwendete Plasmide. (Plasmidkarten einzelner Konstrukte sind im Anhang enthalten (s. Anhang VII.7). Plasmid relevante Eigenschaften Referenz mobilisierbarer E. coli-Vektor, KmR, mcs, lacZ~α sacB E. coli-C. glutamicum shuttle-Expressionsvektor, KmR, Promotor Ptac, mcs, oriE.c. von pACYC177, oriC.g. von pHM1519 T-Überhang-Vektor zur Klonierung von A-Überhang-PCRProdukten, ApR, KmR, mcs, lacZα Vektor zur Klonierung von blunt-end-PCR-Produkten, KmR, ZeoR, mcs, lacZα, ccdB pK18mobsacB mit einem 1.40-kb Fragment, das eine deletierte Version des rpf1-Gens trägt pK18mobsacB mit einem 1.46-kb Fragment, das eine deletierte Version des rpf2-Gens trägt pZ8-1 mit rpf1-Gen stromabwärts des Ptac-Promoters pZ8-1 mit rpf2-Gen stromabwärts des Ptac-Promoters pZ8-1 mit am rpf1-Gen 3’-fusioniertem His-tag stromabwärts des Ptac-Promoters pZ8-1 mit am rpf2-Gen 3’-fusioniertem His-tag stromabwärts des Ptac-Promoters pK18mobsacB pZ8-1 pCR2.1 pCR-Blunt-II pMH22 pMH24 pMH30 pMH31 pMH32 pMH33 Schäfer et al., 1994 Dusch et al., 1999 Invitrogen Invitrogen Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit 1.3 Primer Tab. III.03: In dieser Arbeit verwendete PCR-Primer. Name Sequenz 5’-3’ a rpf1del1 rpf1del2 rpf1del3 rpf2del1 rpf2del2 rpf2del3 rpf1ex1 rpf1ex2 rpf2ex1 rpf2ex2 rpf1his rpf2his rpf1LC1 rpf1LC2 rpf2LC1 rpf2LC2 TACCGCTGCGGCCAAGTCAA TAGCCGACGAAAGCGTTGTATTGTCGCCGTCGAGGTTAGC CACGGCCTCCAACACACCAA CGAATTGTGTGGCCATTG CTATCGGATGCCCAAAAACTTCTTCGCTCTCGG AGCATCAATGATCGGCCA GATCTAGAATTCAAAGGAGGACAACCATGAGAGGAAAACTTTTCATG GATCTAGGATCCCTAGCCGACGAAAGCGTTGTA GATCTAGAATTCAAAGGAGGACAACCTTGTTAATTCCCCCGAGAGC GATCTAGGATCCCTATCGGATGCCCAAGCTTG GATCTAGGATCCCTAGTGATGGTGATGGTGATGGCCGACGAAAGCGTTGTA GATCTAGGATCCCTAGTGATGGTGATGGTGATGTCGGATGCCCAAGCTTGC TAACGGCTACCACGGTGGTC GGTTGGAGCGGAGTTCAGTC TTGGCAGCTCAGAACGTACA AGCTGGAGCTTCTGGATCAT Primerpaare zur Analyse der rpf2-Genregion cl1 cl2 cl3 cl4 cl5 cl6 cl7 cl8 cl9 cl10 GGATGGCTGTGGAGGATGTT; TTGGCAGCTCAGAACGTACA; ACAGACCTGGCTCGCATACG; TGCCGTACAACGTCTCTGTC; GCCGCTGATATTGATCCAAC; GACACATTGCTGGAGGTTGC, GGCCAGGTGTACGCTGCTTA; AGAAGACCTCACCTGGCGTT; CGCGCAGTGCAGGAAGAACA; CGATTAATGCTGCGGCGTAG; GTGACTCCGCCGATAAGCAA AGCTGGAGCTTCTGGATCAT CCACCGCAGTTACTGAAGCA CTTCACGCTAGGCACACCAT CCGCTTAACCAACGCATCCA AATACCTCAGGCGTGGACAG GTCAGCGACGGTGTCGTCAT GGTCTAGGTCATCGAGTTCC GCGAGCCATTGGTCCGACAT GCGAGTGGATCATCATCACC a Restriktionsschnittstellen in 5’-Extensionen der Primer sind fett gedruckt. Eingefügte artifizielle C. glutamicum Ribosomenbindestellen sind unterstrichen. 2 Medien Sofern nicht anders angegeben beziehen sich alle Angaben auf ein Endvolumen von einem Liter. 2.1 Nährmedien LB Vollmedium (Luria Bertani, Sambrook et al., 1989) – 10 g Trypton – 5 g Hefe-Extrakt – 5 g NaCl – 2 g Glukose-Monohydrat (bei Bedarf) pH 7,2 PA Vollmedium (Penassay Broth) – 17,5 g Antibiotic Medium No. 3 SOC Medium – 20 g Trypton – 5 g Hefe-Extrakt – 0,60 g Natriumchlorid (NaCl) – 0,18 g Kaliumchlorid (KCl) – 2,04 g Magnesiumchlorid (MgCl2 • 6 H2O) – 2,46 g Magnesiumsulfat (MgSO4 • 7 H2O) – 4 g Glukose-Monohydrat Minimalmedium MM1 (nach Katsumata et al., 1984, jedoch ohne Hefeextrakt) – 10 g Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) – 3 g Harnstoff – 1 g Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) – 0,4 g Magnesiumsulfat (MgSO4 • 7 H2O) – 1 ml Spurenelementlösung SE-MM1 in 900 ml H2O lösen, autoklavieren, anschließend zugeben: – 2,5 ml Thiamin (0,2 mg/ml), sterifiltriert – 250 µl Biotin (0,2 mg/ml), sterilfiltriert mit C-Quelle und H2O bidest. auf 1 l auffüllen Spurenelementlösung SE-MM1 – 0,2 g Eisensulfat (FeSO4 • 7 H2O) – 0,2 g Magnesiumsulfat (MnSO4 • 7 H2O) – 5 g Calciumchlorid (CaCl2) in 100 ml H2O bidest. lösen, autoklavieren BHIS Medium – 37 g Brain Heart Infusion (Merck) – 91 g Sorbitol 2.2 Zusätze zu Nährmedien Agar – 15 g Agar zur Herstellung von Festmedien vor dem Autoklavieren zugeben C-Quellen sämtliche verwendete C-Quellen für Minimalmedien werden als 10% - 50% Stammlösungen in H2O bidest. getrennt autoklaviert Antibiotika Tab. III.04: Zur Primärselektion verwendete Antibiotikakonzentrationen.
Aminosäuren und sonstige Zusätze als sterilfiltrierte Stammlösungen zusetzen X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galaktosid) – 100 mg X-Gal in 5 ml deionisiertem Dimethylformamid lösen, bei –20°C lagern 2 ml pro 1 l Medium einsetzen IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid) – 119 mg IPTG in 5 ml H2O bidest lösen (= 0,1 M), zu 1 ml aliquotieren, bei –20°C lagern Zur Induktion mit einer Konzentration von 0,5 mM einsetzen 3 Puffer und Lösungen
3.1 Lösungen und Puffer für DNA-Isolierung, -Reinigung und -Bearbeitung SDS-Lösung
HB1
TA-Restriktionspuffer (10-fach)
3.2 Lösungen und Puffer für DNA-Gelelektrophoresen TA-Gelpuffer
Bromphenolblau-Ladungspuffer (BPB) – 50 % (v/v) Glycerin – 1 mM EDTA – 0,05 % (w/v) Bromphenolblau in H2O bidest. lösen, autoklavieren Ethidiumbromid-Färbelösung (EtBr) – 1 µg/ml Ethidiumbromid in H2O TBE-Gelpuffer (10-fach) – 6,11 g Tris – 2,57 g Borsäure – 0,19 g EDTA mit H2O bidest. auf 1 l auffüllen HB2 HB3
3.3 Lösungen für DNA-Transfer Glycerin 10 %
3.4 Lösungen und Puffer für PCR-Reaktionen dNTP-Gemisch – 1 µl dATP (100 mM) – 1 µl dCTP (100 mM) – 1 µl dGTP (100 mM) – 1 µl dTTP (100 mM) – 36 µl H2O bidest PCR-Mastermix (für 4 Reaktionen a 25 µl)
3.5 Lösungen und Puffer zur Darstellung von RNA in denaturierenden Agarosegelen MOPS (10-fach)
Probenpuffer
3.6 Puffer zur Aufreinigung Poly-His-getaggter Proteine mittels magnetischer Ni-NTA Agarosepartikel
3.7 Lösungen und Puffer für SDS-PA-Gelelektrophoresen Probenpuffer (5-fach)
Equilibration Buffer I (EB1)
3.8 Lösungen und Puffer für Proteinfärbungen Coomassie Fixierlösung
Coomassie Brilliant Blue Färbelösung
Schnelle Entfärbelösung (SE) – 450 ml Ethanol – 450 ml H2O bidest. – 100 ml Eisessig Langsame Entfärbelösung (LE) – 7 % (v/v) Eisessig in H2O bidest. Kolloidale Färbelösung A: – 25 %(w/v) Ammoniumperoxidisulfat – 3 %(v/v) Phosphorsäure Kolloidale Färbelösung B: – 75 %(w/v) Ethanol Coomassie-Stammlösung: 0,1 g Coomassie-Brilliant-Blue G250 in 1 l H2O lösen Zur Färbung werden die kolloidalen Färbelösungen A und B im Verhältnis 2:1 gemischt und zu 1l dieser Lösung 4 ml Coomassie-Stammlösung zugesetzt. 3.9 Lösungen und Puffer für tryptischen Proteinverdau und MALDI-TOF MS TDL1
60 % (v/v) Acetonitril (CH3CN) 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) TDL2
– 50 % (v/v) Acetonitril (CH3CN) TDL3
50 % (v/v) Acetonitril (CH3CN) 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat (NH4HCO3) TDL4
50 % (v/v) Acetonitril (CH3CN) 10 mM Ammoniumhydrogencarbonat (NH4HCO3) TDL5
– 10 mM Ammoniumhydrogencarbonat (NH4HCO3) Trypsinlösung 6,6 µg/ml modifiziertes Trypsin in 10 mM Ammoniumhydrogencarbonat (TDL5), frisch ansetzen Matrix-Lösung – 60 % (v/v) Acetonitril (CH3CN) – 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure darin bis zur Sättigung lösen, jeweils frisch ansetzen 3.10 Lösungen und Puffer für Semi-Dry-Blot / Western-Blot Towbin-Transferpuffer – 48 mM TrisBase – 39 mM Glycin – 20% (v/v) Methanol – 0,04% (v/v) SDS in H2O lösen PBS (10-fach) – 1,4 M Natriumchlorid (NaCl) – 27 mM Kaliumchlorid (KCl) – 10 mM Natriumphosphat (Na2PO4) – 18 mM Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4) – in H2O lösen; pH 7,3 – – – – – – – – – – – TBS (10-fach) – 1,5 M Natriumchlorid (NaCl) – 200 mM Tris-HCl – in H2O lösen; pH 7,5 Färbelösung – 1 Tablette Di-Amino-Benzidin (DAB) in 20 ml TBS (1-fach) lösen, 10 min im Dunkeln inkubieren – 30 µl Wasserstoffperoxid (H2O2) – 2 mM Nickelchlorid (NiCl2) Stopplösung: – 2 mM Natriumazid – in H2O lösen 4 Enzyme, Chemikalien, Materialien, Geräte und Software
4.1 Enzyme, Antikörper und Längenstandards Tab. III.05: In dieser Arbeit verwendete Enzyme, Antikörper und Längenenstandards. – Produkt Hersteller Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG Anti-Rabbit-HRP-IgG Deoxyribonuclease I (DNase I) DNA molecular weight marker X Klenow DNA-Polymerase Lysozym Maldi-Peptidstandard Pfu DNA-Polymerase Precision Pro Molecular Weight Marker Pronase E Proteinmarker XII Restriktionsendonukleasen Ribonuclease A (RNase A) rpf2-specific peptidic Antibody Shrimp Alkalische Phosphatase (SAP) T4 DNA Ligase Taq DNA-Polymerase Trypsin (modifiziert) Molecular Probes Roche Serva Roche Roche Serva Sigma Stratagene
Bio-Rad Serva Novex Roche, Invitrogen, Amersham Pharmacia Biotech, Stratagene Serva Eurogentec
Roche Roche
Sigma, Eppendorf, Qiagen Promega 4.2 Chemikalien
Tab. III.06: In dieser Arbeit verwendete Chemikalien. Alle weiteren verwendeten und hier nicht aufgeführten Chemikalien wurden von der Firma Merck (Darmstadt) bezogen. Produkt Hersteller α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure β-Mercaptoethanol 2-Propanol 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-1-propansulfonat (CHAPS) 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoat) (DTNB) 5-Brom-4-Chloro-3-Indolyl-α-Galaktosid (X-Gal)
Acetonitril (CH3CN)
Acetyl-CoA
Acrylamid/Bisacrylamid 37,5:1 Agar
Agarose
Ammoniumpersulfat (APS) Antibiotic Medium No. 3 Antibiotika
Bacto Trypton
Bindesilan
Biotin
Brain-Heart-Infusion
Bromphenolblau, Natrium-Salz (BPB)
Chloroform
Coomassie Brilliant Blue G250 Coomassie Brilliant Blue R250 Diaminobenzidin-Tabletten Dithiothreitol (DTT)
dNTPs
Dye-Reagent Concentrate Eisessig
Ethanol
Ethidiumbromid (EtBr) Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA)
Ficoll 400 Sigma Roth Roth Sigma Sigma Invitrogen Roth Sigma Roth Invitrogen Invitrogen Serva Oxoid Serva, Sigma Difco Amersham Pharmacia Biotech Sigma Merck Serva Roth Serva Serva Sigma Sigma Roche Bio-Rad Roth Roth Serva Amersham Pharmacia Biotech Serva Harnstoff Formaldehyd Hefeextrakt Iodoacetamid IPG Buffer IPG Cover Fluid Magermilchpulver Methanol Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) MSTFA N,N'-Dimethylformamid Natriumdodecylsulfat (SDS) Natriumsuccinat N-Lauroylsarkosin-Natrium-Salz Nukleotide Oxalacetat Pharmalyte Phenol Ponceau-S-Lösung Protokatechosäure Pyridin Rinderserumalbumin (BSA) Salzsäure Schwefelsäure Sephadex G50 TEMED Trifluoressigsäure (TFA) Tris Tween 20 Roth Roth Oxoid Sigma Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech Glücksklee Roth Serva Macherey & Nagel Roth Serva Serva Serva Roche Sigma Amersham Roth Sigma Sigma Pierce Serva Roth Roth Amersham Pharmacia Biotech Serva Roth Sigma Sigma 4.3 Materialien Tab. III.07: In dieser Arbeit verwendete Materialien. Produkt 3MM Papier D NA Primer Elektroporations-Küvetten (0,2 mm) E ppendorfreaktionsgefäße (Eppis) Glasperlen (¨ 1 mm) G laswaren Hybond-N Nylonmembran Immobiline Dry Strips (IPG) Kapillarsäule SPB-50 K üvetten Microcon Centrifugal Filter Devices YM 10 Mikrotiterplatten Ni-NTA Magnetic Beads Nitrocellulosefilter Petrischalen P ipettenspitzen Pufferstreifen Anode/Kathode RNase Zap Reaktionsgefäß mit Deckel 1,5 ml Reaktionsgefäß verschraubbar 1ml + 7ml RiboLyser Blue Tubes S terilfilter Millex GS 0,22 µm Ultrafiltration Membrane YM 10 U ltrafree-4-Centrifugal Devices Ultrafree-15-Centrifugal Devices Hersteller Whatman ARK, Qiagen Bio-Rad G reiner Retsch S chott Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech Supelco P lastibrandt Millipore G reiner Qiagen S artorius Greiner G reiner Amersham Pharmacia Biotech Invitrogen Diagonal Biozym Hybaid S artorius Millipore Millipore Millipore 4.4 Kits Tab. III.08: In dieser Arbeit verwendete Kits. Kit Hersteller Bradford Proteinbestimmung DIG Glycan Detection Kit Nucleotrap Gel Extraction Kit PCR Purification Kit Qiaex II Agarose Gel Extraction Kit Qiagen Plasmid Mini Kit Qiagen Plasmid Spin Prep Kit TOPO TA Cloning Kit TOPO Blunt Cloning Kit 4.5 Geräte Tab. III.09: In dieser Arbeit verwendete Geräte. Gerät BioRad Roche Diagnostics Macherey & Nagel Qiagen Qiagen Qiagen Qiagen Invitrogen Invitrogen Hersteller Amicon Stirring Cell 8050 Autosampler AS 2000 Biofuge Brutschränke Eppischüttler Feinwaagen Gaschromatograph Trace GC Gene Pulser, Pulse Controller Hybridisierungsofen IPGphor Kühlzentrifuge J2-21 Luftschüttler Massenspektrometer Polaris Q MALDI-TOF Mighty Small SE206b Dual Gel Caster Multiphor II Multitemp III PCR-Thermal-Cycler PTC-100 pH-Meter Photometer L-3 Photometer LKB Biochrom 4060 Millipore Thermo Finnigan Heraeus Memmert Eppendorf Sartorius Thermo Finnigan Bio-Rad Bachofer Amersham Pharmacia Biotech Beckmann New Brunswick, Gerhardt Thermo Finnigan Bruker Hoefer Amersham Amersham Pharmacia Biotech MJ Research Knick Perkin Elmer Biosystems Amersham Pharmacia Biotech 4.6 Software zur Gerätesteuerung und Datenanalyse Tab.III.10: In dieser Arbeit verwendete Software Software Hersteller / Referenz Pipettman Reacti-Therm Heating/Stirring Module RiboLyser Spannungsgeber Speedvac Tischzentrifugen Tischkühlzentrifuge Trans-Blot-Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell Ultraschallbad UV-Transilluminator VacuGene XL Videoprinter P67E Wasserbäder Wipptisch Zentrifugen Gilson Thermo Finnigan Hybaid Amersham Pharmacia Biotech Bachofer Hermle, Kontron Eppendorf BioRad Bandelin Electronic UVP Amersham Pharmacia Biotech Mitsubishi Kottermann Elmi Beckmann, Heraeus, Eppendorf BLAST-Local Alignmant Search Tool Clone Manager Professional Suite 6.0 CLUSTALX-Multiple Alignment Tool DiAlign (Version 2.2 Beta) FastA-Programmpaket GenDB (Version 1.5) LightCycler Software 3.5 Mascot Massfrontier Primer Designer (Version 4.20) Staden Sequence Analysis Package Treetool XACQ 4.0 (MALDI TOF) Xcalibur (GC/MS) Xmass (MALDI TOF) Altschul et al., 1997 Scientific & Educational Software Thompson et al., 1997 Morgenstern, 1999 P earson und Lipmann, 1988 Meyer et al., 2003 Roche Diagnostics Perkins et al., 1999 Thermo Finnigan Scientific & Educational Software S taden 1996 ftp://rdp.life.uiuc.edu/pub/RDP/programs/TreeTool B ruker Daltronic Thermo Finnigan B ruker Daltronics 5 Kultivierung von Bakterien 5.1 Bakterienanzucht auf Festmedien und in Flüssigkultur Die Kultivierung von Bakterien auf Festmedien erfolgt durch Ausstreichen von Einzelkolonien und anschließender Inkubation im Brutschrank. Dabei beträgt die Inkubationstemperatur für E. coli 37°C und für C. glutamicum 30°C. Zum Anlegen von Stammplatten werden von Einzelkolonien fraktionierte Ausstriche auf Festmedien gemacht. Die Kultivierung von Bakterien in Flüssigmedien erfolgt durch Animpfung der Kulutr mit einer Einzelkolonie von Festmedium. Kulturen von 5-10 ml werden im Reagenzglas im Roller, größere Mengen im Erlenmeyerkolben im Luftschüttler bei ca. 150-200 rpm angezogen. E. coli wird ü/N bei 37°C bis zur Stationärphase inkubiert. Für C. glutamicum wird ü/N bei 30°C eine Vorkultur angezogen, die -soweit nicht anders angegeben- 1:100 in frisches Medium überimpft wird. 5.2 Lagerung von Bakterien Festmediumplatten können nach der Inkubation für einige Wochen bei 4°C gelagert werden. Zum Schutz vor Austrocknung werden die Platten mit Parafilm umwickelt. Eine dauerhafte Lagerung von Bakterienstämmen erfolgt als Glycerinkultur. Dazu werden die Zellen aus ca. 5-10 ml einer ü/N inkubierten Bakterienkultur durch Zentrifugation pelletiert, in 200 µl LB-Flüssigmedium resuspendiert und mit 800 µl 87 % Glycerin versetzt. Die so erhaltenen Glycerinkulturen können mehrere Jahre bei - 20°C gelagert werden. Zur erneuten Anzucht werden die Glycerinkulturen zum Erhalt von Einzelkolonien auf Festmediumplatten ausgestrichen. 5.3 Bestimmung des Bakterientiters Das Wachstum von Bakterien in Flüssigkultur wird durch Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von λ = 595 nm in einem Spektralphotometer verfolgt. Als Referenz dient steriles Nährmedium. Eine OD595 von 1 entspricht einem Titer von ca. 1 × 108 Zellen pro ml für C. glutamicum und ca. 2 × 108 Zellen pro ml für E. coli. Für die Bestimmung von colony forming units (cfu) wird eine Verdünnungsreihe angelegt, auf Festmediumplatten ausplattiert und nach der Inkubation ausgezählt. 6 Isolierung von DNA
6.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (nach QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol, Qiagen) Zur Isolierung reiner Plasmid-DNA für Sequenzierungen und Klonierungen können kommerziell erhältliche Kits wie z. B. das QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) verwendet werden. Die Vorgehensweise entspricht zunächst einer alkalischen Lyse. Von übrigen Zellbestandteilen befreit, wird die Plasmid-DNA an eine Anionenaustauschersäule gebunden. Durch Waschschritte auf der Säule und anschließende Elution können so in kurzer Zeit große Mengen hochreiner Plasmid-DNA isoliert werden. 5 ml einer selektiv ü/N angezogenen Kultur in ein PE-Röhrchen überführen 5 min bei 3.000 abzentrifugieren alternativ: den gesamten Bakterienrasen einer frischen ü/N inkubierten Festmediumsplatte mit einer Pipette abkratzen und in ein Eppi überführen das Bakterienpellet in 250 µl P1-Puffer aufnehmen 250 µl Puffer P2 zugeben und sofort 6 × invertieren 350 µl Puffer P3 zugeben und sofort 6 × invertieren 10 min Zentrifugation bei 15.000 rpm eine QIAprep Säule in ein 2 ml Eppi stellen zur Bindung der Plasmid-DNA den Überstand der Zentrifugation auf die Säule geben, 1 min bei 15.000 rpm zentrifugieren, den Durchfluss verwerfen 500 µl Puffer PB auf die Säule geben, 1 min Zentrifugation bei 15.000 rpm, den Durchfluss verwerfen 750 µl Puffer PE auf Säule geben, 1 min Zentrifugation bei 15.000 rpm, den Durchfluss verwerfen 1 min Zentrifugation bei 15.000 rpm, um den Waschpuffer PE vollständig zu entfernen die Säule in neues 1,5 ml Eppi stellen 50 µl EB-Puffer oder H2O bidest. auf die Säule geben, 1 min stehen lassen Elution der DNA durch 1 min Zentrifugation bei 15.000 rpm
6.2 Plasmid-DNA-Isolierung aus C. glutamicum Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Corynebakterien entspricht im wesentlichen dem Vorgehen bei E. coli-Zellen. Zuvor wird jedoch die Zellwand durch eine Lysozymbehandlung abgebaut. 10 ml einer selektiv ü/N angezogene Kultur in ein PE-Röhrchen überführen, 5 min bei 3.000 rpm abzentrifugieren alternativ: ca. 40 % des Bakterienrasens einer frischen ü/N inkubierten Festmediumsplatte mit einer Pipette abkratzen die Zellen in einem 1 ml TES resuspendierenund in ein Eppi überführen die Zellen 15 sec bei 15.000 rpm abzentrifugieren und den Überstand verwerfen das Pellet in 200 µl HB1 mit 20 mg/ml Lysozym (frisch angesetzt) und 10 µg/ml RNase A resuspendieren 2 bis 3 h bei 37°C im Roller inkubieren 400 µl HB2 zugeben und sofort 6 × invertieren das Eppi 3 min auf Eis abkühlen 300 µl HB3 zugeben und sofort 6 × invertieren 15 min Zentrifugation bei 15.000 rpm den Überstand in ein neues Eppi überführen und mit 500 µl Phenol/Chloroform mischen 3 min Zentrifugation bei 15.000 rpm die obere Phase in ein neues Eppi überführen, 900 µl Isopropanol (-20°C) zusetzen und mehrmals invertieren 30 min Zentrifugation bei 15.000 rpm und 4°C den Überstand verwerfen und das DNA-Pellet mit 500 µl 70 % Ethanol waschen 15 min Zentrifugation bei 15.000 rpm und den Überstand quantitativ entfernen das DNA-Pellet 5 min bei 60°C trocknen und anschließend in 20 µl H2O bidest. aufnehmen 6.3 Isolierung chromosomaler DNA aus C. glutamicum Zur Darstellung chromosomaler DNA aus C. glutamicum wird zunächst deren Zellwand durch Lysozym-Einwirkung abgebaut und die so erzeugten Sphäroplasten anschließend durch Detergenz-Behandlung lysiert. Durch PronaseE-Behandlung und Phenolisierung werden die Proteine extrahiert und die chromosomale DNA durch Ethanolfällung isoliert. 10 ml LBG-Medium werden mit einer Einzelkolonie beimpft und ü/N bei 30°C im Roller inkubiert die Kultur in ein PE-Röhrchen überführen, 5 min Zentrifugation bei 3.000 rpm das Pellet mit 10 ml TES waschen, 5 min Zentrifugation bei 3.000 rpm das Pellet in 3 ml HB1 mit 20 mg/ml Lysozym (frisch ansetzen) resuspendieren 2 bis 3 h bei 37°C im Roller inkubieren 200 µl 20 % SDS zugeben und invertieren bis die Lösung aufklart 5 min auf Eis stellen, eine Spatelspitze PronaseE zugeben 1 bis 2 h bei 37°C im Roller inkubieren 3 ml Phenol/Chloroform zugeben und unter vorsichtigem Invertieren gut vermischen 10 min Zentrifugation bei 8.000 rpm und 4°C im JA17-Rotor den Überstand vorsichtig mit einer abgeschnittenen blauen Spitze abnehmen und in ein neues PE-Röhrchen überführen die Phenolisierung des Überstandes mindestens ein weiteres Mal mit 3 ml Phenol/Chloroform wiederholen den Überstand in ein neues PE-Röhrchen überführen, mit 96 % Ethanol (-20°C) auf 12 ml auffüllen und invertieren bis die DNA ausfällt 20 min Zentrifugation bei 10.000 rpm und 4°C im JA17-Rotor das DNA-Pellet mit 4 ml 70 % Ethanol waschen, 5 min Zentrifugation bei 10.000 rpm und 4°C im JA17-Rotor den Überstand quantitativ verwerfen und das Pellet 5 min bei 60°C trocknen das Pellet in 100 bis 300 µl H2O bidest. bei 60°C lösen, in ein Eppi überführen und bei 4°C lagern 7 Reinigung von DNA 7.1 Sephadex-Gelfiltration (Sambrook et al., 1989) Durch Sephadex-Säulengelfiltration können Substanzen aufgrund ihrer unterschiedlichen Molekulargewichte getrennt werden. Das Ausschlussvolumen der Poren erlaubt kleineren Molekülen das Eindringen in das Material, während größere Moleküle wie z. B. Plasmid-DNA nicht beeinflusst werden. Verunreinigungen in der DNA-Lösung wie Salze, Nukleotide oder Phenol werden beim Durchfluss durch die Säule zurückgehalten und somit herausgefiltert. ca. 5 g Sephadex G50 2 h in 100 ml H2O bidest. quellen lassen überschüssiges H2O abgießen, zweimal durch frisches H2O bidest. ersetzen und jeweils zwei weitere Stunden quellen lassen. Anschließend die Sephadexlösung autoklavieren zur Silikonisierung von Glaskügelchen (¨ ca. 1 mm) diese in Silikonlösung tränken, die Lösung abgießen und die Kügelchen 1 h bei 180°C in offenem Gefäß backen ein silikonisiertes Glaskügelchen in eine blaue Spitze geben und die Spitze danach in ein Weichagar-Röhrchen stellen 700 µl sterile Sephadex-Lösung in die Spitze pipettieren 10 min Zentrifugation bei 3.000 rpm zum Packen der Säule die gepackte Säule in ein neues Weichagar-Röhrchen stellen die DNA-Lösung auf das trockene, gepackte Sephadex-Material geben 10 min Zentrifugation bei 3.000 rpm die durchgelaufene und auf diese Weise gereinigte DNA-Lösung weiterverwenden 7.2 Bestimmung der DNA-Konzentration (Sambrook et al., 1989) DNA-Konzentrationen können durch Bestimmung der optischen Dichte bestimmt werden. Eine OD260 von 1 entspricht ca. 50 µg doppelsträngiger DNA bzw. 33 µg einzelsträngiger DNA pro ml. Die Reinheit der DNA wird durch den Vergleich der Extinktionen bei den Wellenlängen 260 und 280 nm kontrolliert. Reine DNA besitzt einen Quotienten OD260/OD280 von 1,65 bis 1,85. 8 DNA-Analysen 8.1 Agarose-Gelelektrophorese (Sambrook et al., 1989) Mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese lassen sich DNA-Fragmente in Abhängigkeit von ihrer Molekülgröße auftrennen. Die Wanderungsgeschwindigkeit im Gel ist abhängig vom Molekulargewicht, der DNA-Konformation, der Agarose-Konzentration sowie der angelegten Feldstärke. Die Laufstrecke linearer, doppelsträngiger DNA-Moleküle verhält sich umgekehrt proportional zu ihrem Molekulargewicht bzw. zu ihrer Länge in Basenpaaren. Zur Größenbestimmung unbekannter DNA-Fragmente wird ein Längenstandard bei der Elektrophorese als Referenz zusätzlich auf das Gel aufgetragen. Die eingesetzte Agarose-Konzentration bei der Agarose-Gelelektrophorese beträgt je nach Größe der aufzutrennenden Fragmente zwischen 0,8 % und 4 %. Als Elektrophorese-Puffer dient TA-Gelpuffer. Um ein Absinken der DNA-Proben in die Geltaschen zu gewährleisten, wird die DNA mit glycerinhaltigem Bromphenolblau-Ladungspuffer (BPB) versetzt. Während der Elektrophorese bei einer Spannung von 50 bis 120 V und einer maximalen Stromstärke von 400 mA dient das Bromphenolblau als Marker für die Laufstrecke. In die DNA interkalierendes Ethidiumbromid (EtBr) und anschließende UV-Beleuchtung des Gels ermöglichen eine Visualisierung der DNA. 0,8 % bis 4 % Agarose solange in TA-Gelpuffer aufkochen bis die Agarose vollständig gelöst ist die Agaroselösung auf ca. 60°C abkühlen lassen, in eine Gelkammer einfüllen und sofort einen Gelkamm einsetzen das Gel nach dem Auspolymerisieren mit TA-Gelpuffer überschichten und den Kamm entfernen die DNA-Proben und einen Längenstandard mit jeweils 3 µl BPB versetzen und in die Geltaschen einfüllen die elektrophoretische Trennung bei einer Spannung von 50 bis 120 V und einer Stromstärke von maximal 400 mA durchführen nach Beendigung des Elektrophoreselaufs das Gel 5 min in EtBr-Lösung (10 µg/ml) färben und 1 min in H2O entfärben Geldokumentation durch Fotografieren bei UV-Anregung auf einem Transilluminator 8.2 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Nach der elektrophoretischen Auftrennung von DNA-Fragmenten im Agarosegel können definierte Fragmente z. B. für anschließende Klonierungen oder PCR-Experimente wieder reisoliert werden. Nach schwachem Anfärben des Gels mit Ethidiumbromid und bei möglichst kurzer UV-Bestrahlung wird das entsprechende Fragment mit einem Skalpell ausgeschnitten und in ein Eppi überführt. Die Aufreinigung der DNA erfolgt anschließend z. B. mit dem Nucleotrap Extraction Kit for Nucleic Acids (Macherey & Nagel). das DNA-Fragment möglichst zügig aus dem Agarosegel bei schwachem UV-Durchlicht, um Mutationen zu vermeiden, ausschneiden und in ein Eppi überführen pro 100 mg Agarose 300 µl Puffer NT1 zugeben; 15 µl Nucleotrap Suspension zugeben und vortexen 10 min Inkubation im Wasserbad bei 50°C, dabei die Suspension alle 2 bis 3 min durch Vortexen durchmischen 30 sec Zentrifugation bei 15.000 rpm, den Überstand verwerfen 500 µl Puffer NT2 zugeben, vortexen, 30 sec Zentrifugation bei 15.000 rpm und den Überstand verwerfen den Waschschritt mit Puffer NT2 wiederholen, anschließend zweimal mit Puffer NT3 waschen den Überstand quantitativ entfernen und das Pellet 10 min bei Raumtemperatur unter einem Abzug trocknen das Pellet in 20 bis 50 µl H2O bidest. resuspendieren 9 Klonierungsexperimente 9.1 DNA-Restriktion (Sambrook et al., 1989) Die Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen erfolgt gemäß den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen unter Verwendung der mitgelieferten Puffer oder von TA-Restriktionspuffer. Die Inaktivierung von Restriktionsenzymen kann durch 20 min Hitzebehandlung bei 65°C bzw. 85°C erreicht werden. 9.2 Erzeugung von blunt ends Um nicht-kompatible sticky end-DNA-Fragmente ligieren zu können, müssen diese in blunt ends umgewandelt werden. Das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase besitzt 5'¨3'-Polymeraseaktivität sowie 3'¨5'-Exonukleaseaktivität. Mit diesem Enzym können daher sowohl 5'-Überhänge durch Auffüllen als auch 3'-Überhänge durch Abbau nicht gepaarter Nukleotide in blunt ends überführt werden. Die so erzeugten blunt ends sind in beliebiger Kombination ligierbar. ca. 20 µl eines Spaltungsansatzes hitzeinaktivieren 3 µl TA-Restriktionspuffer und 1 µl Klenow DNA-Polymerase (2 bis 4 U/µl) zusetzen je 1 µl der benötigten dNTPs (10 mM) zugeben mit H2O bidest. auf 30 µl auffüllen 60 min Inkubation bei 37°C Inaktivierung des Enzyms durch 20 min Hitzebehandlung bei 70°C oder Phenolisierung Abtrennung freier Nukleotide durch Sephadex-Behandlung 9.3 5'-Dephosphorylierung gespaltener DNA Um die Religation gespaltener DNA zu verhindern, können DNA-Fragmente mit alkalischer Phosphatase (shrimp Alkalische Phosphatase, SAP) behandelt werden. Die Abspaltung der 5'-Phosphatgruppen an den Enden der linearisierten DNA verhindert eine erneute Religation. Dephosphorylierte DNA-Fragmente können nur mit phosphorylierter DNA ligiert werden. Die SAP-Behandlung erfolgt unter den vom Hersteller genannten Bedingungen. Die dephosphorylierte DNA muss vor der Weiterverarbeitung aufgereinigt werden. 9.4 Ligation von DNA Die DNA-Ligation erfolgt ATP-abhängig durch die Aktivität der T4-DNA-Ligase, die 3'-OH-Gruppen mit 5'-Phosphatgruppen doppelsträngiger DNA-Moleküle verknüpft. Kompatible sticky end Fragmente können dabei ebenso ligiert werden wie beliebige blunt end-Fragmente. Vor der Ligation müssen die Restriktionsendonukleasen aus den DNA-Spaltungsansätzen inaktiviert werden. Die Insert-DNA wird bei der anschließenden Ligationsreaktion in der Regel im Überschuss (ca. 7:1) zur Vektor-DNA zugegeben. Ligationsansatz aus: ca. 20 µl gespaltene Insert-DNA (abhängig von ihrer Konzentration) ca. 3 µl gespaltene Vektor-DNA (abhängig von ihrer Konzentration) 4 µl ATP-haltiger T4-Ligasepuffer 2 µl T4-DNA-Ligase mit H2O bidest. auf 40 µl auffüllen das Eppi mit dem Ligationsansatz in eine mit ca 20°C warmen Wasser gefüllte Isolierkanne überführen und ü/N auf 4°C im Kühlschrank abkühlen der Ligationsansatz muß vor einer Elektroporation durch eine Sephadex-Gelfiltration deionisiert werden 10 DNA-Transfer 10.1 Elektrotransformation von E. coli-Zellen (nach Gene Pulser Manual, Bio-Rad) Zur DNA-Transformation durch Elektroporation werden vorbehandelte E. coli-Zellen mit freier DNA vermischt und einer elektrischen Feldstärke von über 10 kV/cm ausgesetzt, wodurch es zur Aufnahme der DNA in die Zellen kommt. DNA und Zellsuspension müssen ionenfrei sein, um einen erhöhten Stromfluss durch die Lösung zu vermeiden. Die Entladezeiten des Kondensators liegen bei optimaler Durchführung über 5 ms. Es wurden der Gene Pulser und Pulse Controller sowie Elektroporationsküvetten der Firma Bio-Rad (München) verwendet. Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen: Eine E. coli-Einzelkolonie in 5 ml LBG-Medium überimpfen und ü/N bei 37°C im Roller inkubieren 2,5 ml der Vorkultur in 250 ml LBG-Medium überimpfen und bei 37°C und 150 rpm bis zu einer OD580 von 0,5 bis 0,7 anziehen die Zellen 15 min in Eiswasser abkühlen, alle weiteren müssen Schritte auf Eis ausgeführt werden, die Lösungen und Zentrifugen müssen vorgekühlt werden 250 ml der Kultur 15 min bei 6.000 rpm im JA10-Rotor abzentrifugieren den Überstand abgießen und den Rücklauf vollständig abziehen den Zentrifugenbecher zweimal mit ca. 20 ml H2O bidest. vorsichtig ausspülen, ohne das Pellet zu lösen das Pellet in ca. 5 ml H2O bidest. lösen und danach mit H2O bidest. auf 250 ml auffüllen die Zellen 15 min bei 5.000 rpm abzentrifugieren den Überstand sofort abgießen und das Zellpellet im Rücklauf resuspendieren die Suspension in 50 ml 15 % Glycerin aufnehmen und auf zwei JA20- Zentrifugenbecher verteilen 15 min Zentrifugation bei 5.000 rpm und den Überstand anschließend vollständig abziehen das Pellet in 0,5 bis 1 ml 15 % Glycerin aufnehmen die Zellen zu je 60 µl in Eppis aliquotieren, bei -80°C schockgefrieren und lagern Elektroporation kompetenter E. coli-Zellen: kompetente E. coli-Zellen auf Eis auftauen, DNA und Küvetten ebenfalls auf Eis stellen Pulsbedingungen: - Kapazität: 25 µF -Widerstand: 400 ¨ -Spannung: 2,5 kV (bei 0,2 cm Küvetten) 3 bis 20 µl ionenfreie DNA zu 60 µl aliquotierter Zellsuspension geben 1 min auf Eis inkubieren die Suspension ganz nach unten in eine Elektroporationsküvette pipettieren die Küvette abtrocknen, in die Gene Pulser Apparatur stellen und den Puls auslösen sofort 1 ml SOC-Medium in die Küvette geben und kurz mit den Zellen durchmischen die Zellen in ein Eppi überführen und 60 min bei 37°C regenerieren die Zellen anschlißend in verschiedenen Mengen auf Selektionsmedium ausplattieren 10.2 Elektrotransformation von C. glutamicum (nach Tauch et al., 2002) Herstellung elektrokompetenter C. glutamicum-Zellen: eine C. glutamicum-Einzelkolonie in 50 ml BHIS-Medium überimpfen und ü/N bei 30°C und 175 rpm inkubieren 5 ml der Vorkultur als Inokulum für 250 ml auf 30°C vorgewärmtes BHIS-Medium verwenden und die Kultur bei 30°C und 175 rpm bis zu einer OD580 von ca. 1,75 anziehen die Zellen 10 min auf Eis abkühlen, alle weiteren Schritte müssen auf Eis ausgeführt werden, die Lösungen und Zentrifugen müssen vorgekühlt werden zweimal 125 ml der Kultur 15 min bei 4°C und 6.000 rpm abzentrifugieren den Überstand abgießen und den Rücklauf vollständig abziehen das Pellet in 2 ml TG-Puffer resuspendieren, in zwei sterile JA17-Zentrifugenbecher überführen und mit TG-Puffer auf jeweils 25 ml auffüllen 10 min Zentrifugation 6.000 rpm bei 4°C den Überstand abgießen und den Rücklauf vollständig abziehen den Waschschritt mit 25 ml TG-Puffer wiederholen den Waschschritt zweimal mit 25 ml 10 % Glycerin wiederholen das Pellet in 1 ml 10 % Glycerin resuspendieren und die Zellen in vorgekühlten Eppis zu je 150 µl aliquotieren, bei –80°C schockgefrieren und lagern Elektroporation kompetenter C. glutamicum-Zellen: ein Reagenzglas mit 4 ml BHIS-Medium 5 min in einem 46 °C Wasserbad vorwärmen kompetente C. glutamicum-Zellen auf Eis auftauen, DNA und Küvetten ebenfalls auf Eis stellen Pulsbedingungen einstellen: - Kapazität: 25 µF - Widerstand: 200 ¨ - Spannung: 2,5 kV 3 bis 20 µl ionenfreie DNA zu 150 µl aliquotierter Zellsuspension geben 1 min auf Eis inkubieren die Suspension ganz nach unten in eine 0,2 cm Elektroporationsküvette pipettieren die Suspension vorsichtig mit 0,8 ml 10 % Glycerin überschichten (die Küvette schräg halten, damit sich die Schichten nicht durchmischen) die Küvette abtrocknen, in die Gene Pulser Apparatur stellen und den Puls auslösen, die Zellen sofort in ein Reagenzglas mit 4 ml auf 46°C vorgewärmtes BHIS-Medium geben, und die Küvette anschließend mit 1 ml des BHIS ausspülen die Zellen im Reagenzglas 6 min in einem 46°C warmen Wasserbad inkubieren anschließend 50 min bei 30°C im Schüttler regenerieren die Zellen in ein PE-Röhrchen überführen und 5 min bei 3.000 rpm zentrifugieren und anschließend den Überstand verwerfen die Zellen in 600 µl BHIS resuspendieren und in verschiedenen Mengen auf Selektionsmedium ausplattieren Auf den Hitzeschock bei 46°C kann bei der Elektroporation replikativer Plasmide in restriktionsdefekte C. glutamicum-Stämme (wie z. B. RES167) verzichtet werden; die Transformationsfrequenz sinkt in diesem Fall allerdings auf ca. 20 % (Kirchner und Tauch, 2003). 11 Polymerase-Kettenreaktion Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) dient der gezielten enzymatisch katalysierten Amplifikation von DNA-Molekülen in vitro (Mullis et al., 1986). Durch automatisierte, sich wiederholende Zyklen aus Denaturierung, Primerbindung und Polymerisation kommt es dabei unter optimalen Bedingungen pro Zyklus zu einer Verdoppelung des zwischen den Primern liegenden DNA-Fragmentes, also einer exponentiellen Anreicherung der Ziel-DNA. Im ersten Schritt eines PCR-Zyklus wird die Ursprungs-DNA (template) durch Hitzedenaturierung in Einzelstränge aufgeschmolzen. Eine Absenkung der Temperatur führt im nächsten Schritt zur Bindung (annealing) der Primer an die komplementären Sequenzen der einzelsträngigen template-DNA. Von den Primern ausgehend wird anschließend im dritten Schritt der zwischen ihnen liegende Bereich der template-DNA durch eine thermostabile DNA-Polymerase in 5'¨3'-Richtung amplifiziert. Die PCR-Reaktionen wurden mit einem PCT-100 Thermocycler (MJ Research Inc.) durchgeführt. Neben der template-DNA, spezifischen Primern und einer thermostabilen Polymerase (Taq- bzw. Pfu-Polymerase) werden für die PCR-Reaktion magnesiumhaltiger Polymerase-Puffer und dNTPs benötigt. Im Gegensatz zur Taq-Polymerase verfügt die Pfu-Polymerase über eine 3'¨5'-Exonukleaseaktivität, die die Fehlerrate bei der Amplifikation deutlich reduziert (proof-reading). Die Pfu-Polymerase produziert zudem keine A-Überhänge an den 3'-Enden der Amplifikate, so dass eine direkte blunt end-Klonierung der erzeugten DNA-Moleküle möglich ist. 11.1 PCR-Primerdesign Die Qualität der Primer ist für die Spezifität und Effizienz der PCR-Reaktion von entscheidender Bedeutung (McPherson, 1995). Um eine ausreichende Spezifität zu gewährleisten, sollten Primer eine Länge von mindestens 17 Nukleotiden (nt) haben; ab einer Länge von 30 nt ist jedoch keine Zunahme der Spezifität mehr zu erwarten. Die Längen der verwendeten Primer sowie deren Schmelztemperaturen sollten möglichst identisch sein, der G+C-Gehalt dabei zwischen 50 und 60 % liegen. Zur einfachen Berechnung der Schmelztemperatur (Tm) eines Primers kann folgende Formel verwendet werden: Tm [°C] = 2(A+T) + 4(G+C) Zusätzliche 5'-Extensionen, z. B. eingefügte Restriktionsschnittstellen, werden bei dieser Berechnung nicht berücksichtigt. Beim Design der Primer muß ferner die Entstehung Primer-Dimeren und die Ausbildung von Haarnadelstrukturen innerhalb der Primer vermieden werden. Für die Berechnung und Analyse von Primersequenzen wurde das Programm Primer Designer, Version 4.20 (Scientific & Educational Software) verwendet. 11.2 PCR-Reaktion PCR-Reaktionsgemisch: 1 µl template–DNA je 0,5 µl Primer, Konzentration 50 µM 23 µl PCR-Mastermix – das PCR-Reaktionsgefäß verschließen, in den Thermoblock stellen und das Programm starten PCR-Programm:
11.3 Aufreinigung von PCR-Amplifikaten (QIAquick PCR Purification Kit Protocol, Qiagen) Um überschüssige Primer-Moleküle, Polymerasen, Salze und Nukleotide aus PCR-Ansätzen zu entfernen, wurde das PCR Purification Kit (Qiagen) verwendet. eine QIAquick Aufreinigungssäule in ein 2 ml Eppi stellen die PCR-Reaktion mit dem 5-fachen Volumen PB-Puffer versetzen und auf die Säule geben, um die DNA an das Säulenmaterial zu binden 60 sec Zentrifugation bei 15.000 rpm, den Durchfluss anschließend verwerfen 750 µl PE-Puffer auf die Säule geben 60 sec Zentrifugation bei 15.000 rpm, den Durchfluss verwerfen, erneut 60 sec bei 15.000 rpm zentrifugieren, um den PE-Puffer vollständig zu entfernen die Säule in ein neues 1,5 ml Eppi stellen 50 µl EB-Puffer oder H2O bidest. auf Säule pipettieren, 1 min stehen lassen Elution der DNA durch 1 min Zentrifugation bei 15.000 rpm 12 Klonierung von PCR-Amplifikaten (TOPO Cloning Kit Manual, Invitrogen) PCR-Produkte, die unter Verwendung von proofreading-Polymerasen (z. B. Pfu) amplifiziert wurden und über blunt ends verfügen, können nach Aufreinigung direkt in linearisierte Vektoren kloniert werden. Sehr effizient kann dies mit kommerziell erhältlichen linearisierter Vektoren ( wie z. B. dem pCR-BluntII, Invitrogen) durchgeführt werden. Zur Katalyse der Ligation besizten diese Vektoren eine an ihrem 3'-Ende gebundene DNA-TopoisomeraseI. Mit Taq-Polymerase amplifizierte PCR-Produkte besitzen hingegen einen Adenosin-Überhang am 3'-Ende. Die Klonierung dieser Amplifikate wird durch linearisierte Vektoren, die einen T-Überhang und DNA-TopoisomeraseI am 3'-Ende tragen (z. B. pCR2.1,Invitrogen) vereinfacht. In den jeweiligen Kits enthaltene, chemisch kompetente E. coli-Zellen können für die Transformation der TopoisomeraseI-katalysierten Ligationsansätze verwendet werden. Ligationsansatz: 0,5 bis 4 µl PCR-Produkt 1 µl salt solution (1,2 M NaCl, 60 mM MgCl2) 1 µl Vektor (pCR-BluntII-TOPO oder pCR2.1-TOPO) den Ansatz mit H2O bidest. auf 6 µl auffüllen und sofort in einem Eppi vermischen 2 bis 5 min Inkubation bei Raumtemperatur das Eppi auf Eis stellen und den Ligationsansatz sofort für die Transformation einsetzen Transformation: ein Aliquot kompetenter E. coli-Zellen (TOP10) auf Eis auftauen 2 µl des Ligationsansatzes mit dem Aliquot kompetenter Zellen vermischen, nicht vortexen 5 min Inkubation auf Eis 30 sec Hitzeschock bei 42°C und die Zellen anschließend auf Eis abkühlen 250 µl SOC-Medium zugeben und die Zellen1 h bei 37°C regenerieren 50 und 200 µl des Transformationsansatzes auf Selektionsmedium mit X-Gal ausplattieren, ü/N bei 37°C inkubieren 13 Gendeletion durch die „Gene-SOEing“-Methodik (Horton, 1995) Um Deletionen möglichst rasch und gezielt im Genom von C. glutamicum zu etablieren, wurde die Methode des Gene-Splicing by Overlap Extension (GeneSOEing) angewendet. Bei dieser Technik werden DNA-Fragmente in vitro während einer PCR-Reaktion neu kombiniert. Sie basiert auf einer Erweiterung am 5’-Ende des zweiten Primers, die das reverse Komplement eines dritten Primers (c’) darstellt, der an einer anderen Stelle des Templates bindet. In einer zweiten PCR-Reaktion fungiert das Amplifikat der ersten PCR-Reaktion als Primer (c), zusammen mit einem vierten Primer (d) entsteht so ein Fusionsprodukt (Abb. III.01). So können Gene oder Genabschnitte fusioniert bzw. gezielt deletiert werden.
Abb.III.01: Schematische Darstellung des GeneSOEing. Um eine chromosomale Deletion zu etablieren, werden die Bereiche vor und hinter dem zu deletierenden Bereich fusioniert und das Produkt unter Benutzung des sacB-Selektionssystems (Schäfer et al. 1994) gegen den intakten Abschnitt des Chromosoms ausgetauscht. Bei Verwendung des pK18mobsacB Vektors wird durch Selektion auf Kanamycin zunächst auf die über homologe Rekombination stattfindende Integration des inserttragenden Vektors selektioniert. Nachfolgend kann auf sucrosehaltigem (10%) Medium auf den Verlust des Vektors, der in C. glutamicum nicht replizieren kann, selektioniert werden. Der Vektor kann auf zwei Weisen aus dem Chromosom desintegrieren. Im ersten Fall erfolgt eine homologe Rekombination über dieselbe Flanke wie beim ersten Rekombinationsereignis und der ursprüngliche Genotyp wird wiederhergestellt. Die Mutante revertiert zum Wildtyp. Erfolgt die zweite homologe Rekombination aber innerhalb der anderen Flanke, verbleibt das die Deletion beinhaltende PCR-Produkt im Chromosom, während das Wildtyp-Allel verloren geht.
13.1 PCR-Schnelltest zum Nachweis von Integrationen und Deletionen im C. glutamicum Chromosom Der PCR-Schnelltest dient dazu, Integrationen von Plasmiden zur Gendisruption bzw. Deletionen im Chromosom von C. glutamicum mittels PCR nachzuweisen, ohne zuvor eine Gesamt-DNA Isolierung (vgl. Abschnitt III.6.4) durchführen zu müssen (Abb.III.02). Die für die PCR benötigte template-DNA wird durch kurzes Aufkochen der C. glutamicum-Zellen erhalten. Als Primer dienen drei (Integration) bzw. vier (Deletion) Oligonukleotide, deren Bindestellen wie folgt gewählt werden: Integrationsnachweis: P1 = knapp außerhalb vom 5‘-Bereichs des Integrationsfragments P2 = Vektorspezifischer Primer im 3‘-Bereich des Integrationsfragments P3 = knapp außerhalb des 3‘-Bereichs des Integrationsfragments
Bei erfolgreicher Integration muß die Primerkombination P1/P2 ein Fragment der entsprechenden Größe ergeben, bei der Kombination P1/P3 darf hingegen kein Amplifikat auftreten. Deletionsnachweis: Pa = knapp außerhalb vom 5‘-Bereichs des deletierten Bereiches Pb = knapp außerhalb vom 3‘-Bereichs des deletierten Bereiches Pc = 5‘-Primer eines innerhalb des Deletionsbereiches liegenden Abschnittes Pd = 3‘-Primer eines innerhalb des Deletionsbereiches liegenden Abschnittes Bei erfolgter Deletion muß eine PCR-Reaktion mit der Primerkombination Pa/Pb ein Amplifikat definierter Größe ergeben. Aus der Primerkombination Pc/Pd darf in einem entsprechenden Ansatz hingegen kein Amplifikat resultieren.
Abb.III.02: Schematische Darstellung des Integrations- bzw. Deletionsnachweises durch PCR Sollte das vollständige Deletionskonstrukt noch integriert vorliegen, würden beide Primerkombinationen ein PCR-Produkt ergeben. mit einem Stocherholz etwa die Hälfte eines C. glutamicum Stocherstriches im Eppi in 100 µl H2O bidest. resuspendieren die Zellsuspension 2 × 30 sec in der Mikrowelle bei 800 Watt aufkochen und anschließend auf auf Eis abkühlen einen PCR-Mastermix mit Taq-DNA-Polymerase + 1/5 Volumen Enhancer (Eppendorf) verwenden 1 µl der Zellsuspension als template-DNA in einem 25 µl PCR-Reaktionsansatz einsetzen 14 Auswertung von DNA- und Aminosäuresequenzen Zur Assemblierung von Sequenzdaten sowie der Analyse von DNA- und abgeleiteten Proteinsequenzen wurde das Staden sequence analysis package (Staden, 1996) in der Version 02.0 und das FASTA-Programmpaket (Pearson and Lipman, 1988) verwendet. Homologievergleiche von DNA- und Proteinsequenzen mit in aktuellen Versionen der Datenbanken EMBL, GenBank und SWISSPROT zugänglichen Sequenzdaten erfolgte unter Verwendung des BLAST search programs (Altschul et al., 1997). Multiple alignments von Proteinsequenzen wurden mit dem Programm DIALIGN (Morgenstern 1999) berechnet und dem Programm CLUSTAL X visualisiert (Thompson et al., 1997). DNA-Sequenzen des C. glutamicum-Genomprojekts wurden automatisch mit dem GenDB-Programmpaket (Meyer et al. 2003) annotiert. 15 RNA-Isolierung Bakterienzellen müssen zur Isolierung von RNA schnellstmöglich abgetötet und aufgeschlossen werden, um sicherzustellen, dass das Transkriptom während der Aufarbeitung keinen Veränderungen unterliegt. Aus diesem Grund werden die Zellen zunächst in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Der Aufschluß erfolgt anschließend im Ribolyser. Hierbei werden die Zellen durch sehr stark beschleunigte Glas- oder Quarzsandpartikel zerrieben. Proteine, Zellwandbestandteile und andere Zellkomponenten können nachfolgend durch Zentrifugation abgetrennt werden. Die wasserlöslichen Nukleinsäuren (DNA und RNA) verbleiben dabei im Überstand. Die Aufreinigung der RNA erfolgt anschließend über spezielle Silikatsäulen, wobei verbliebene DNA enzymatisch durch RNase-freie DNase abgebaut wird. Die Qualität der isolierten RNA kann sowohl photometrisch als auch in denaturierenden Agarosegelen überprüft werden. RNA-Proben werden durch PCR auf eine eventuelle Verunreinigung mit DNA unter-sucht. Aus 2 × 109 C. glutamicum Zellen können in der Regel 50-70 µg Gesamt-RNA isoliert werden. 15.1 Gesamt-RNA-Isolierung aus C. glutamicum Zellen (RNeasy-Mini-Kit Protocol, Qiagen; ) Ernte von C. glutamicum-Zellen – Ca. 1 × 109 Zellen in einem Eppi pelletieren – den Überstand verwerfen und die Zellen sofort in flüssigem Stickstoff schockgefrieren – ggf. bei – 80°C lagern RNA-Isolierung ein gefrorenes Pellet in 800 µl RLT Puffer aufnehmen und zügig in ein Ribotube überführen (der RLT-Puffer muß mit β-Mercaptoethanol versetzt werden) die Suspension zweimal im Hybaid-Ribolyser bei Speed 6,5 für 30 sec ribolysieren, die Proben dazwischen auf Eis abkühlen das Ribolysat für 15 min bei 14.000 rpm und 4°C abzentrifugieren den Überstand in ein Eppi überführen und mit 250 µl Ethanol vermischen das Gemisch auf eine RNeasy-Säule geben, für 30 sec zentrifugieren und den Durchlauf verwerfen 700 µl RW1-Puffer zugeben, für 30 sec zentrifugieren und den Durchlauf verwerfen die Säule in neues 2 ml Tube stellen und 500 µl RPE-Puffer zugeben (der RPE-Puffer muß mit Ethanol versetzt werden) Zentrifugation für 30 sec und den Durchlauf anschließend verwerfen 500 µl RPE-Puffer zugeben, für 30 sec zentrifugieren und den Durchlauf verwerfen die Säule 1 min trockenzentrifugieren und in neues Eppi (aus Kit) stellen 50 µl RNase freies Wasser zugeben, 1 min einwirken lassen und durch Zentrifugation für 1 min eluieren das Eluat auf Eis aufbewahren 15.2 RNA-Reinigung und DNase-Behandlung (RNeasy-Mini-Kit Protocol, Qiagen) das RNA-Eluat mit 350 µl RLT-Puffer vollständig durchmischen 250 µl Ethanol, durchmischen und die Lösung auf eine RNeasy-Säule geben Zentrifugation für 30 sec und den Durchlauf verwerfen 10 µl DNase mit 70 µl RDD-Puffer vermischen und auf die Säule geben Inkubation für 30 min bei 25°C 500 µl RW1-Puffer zugeben Zentrifugation für 30 sec und die Säule anschließend in neues Eppi stellen 500 µl RPE-Puffer zugeben Zentrifugation für 30 sec und den Durchlauf verwerfen 500 µl RPE-Puffer zugeben Zentrifugation für 30 sec und den Durchlauf verwerfen 1 min trockenzentrifugieren und die Säule in ein neues Eppi stellen 50 µl RNase freies H2O zugeben 1 min einwirken lassen und durch Zentrifugation für 1 min eluieren Elution wiederholen und das erhaltene Eluat auf Eis aufbewahren 15.3 Bestimmung von RNA-Reinheit und RNA-Konzentration Im Biophotometer wird die Extinktion der RNA-Proben bei Wellenlängen von λ = 230, 260, 280 und 320 nm bestimmt und die jeweiligen Quotienten berechnet. Der Quotient E260/E280 gibt Auskunft über die Reinheit der Probe, er sollte zwischen 1,7 und 2,0 liegen (Farell, 1993; Lottspeich und Zorbas, 1998). Der Messwert für λ = 320 nm gibt die Trübung der Probe (z. B. durch Proteinverunreinigungen) an und sollte gleich 0 sein. Die Messungen erfolgen in speziellen Plastikküvetten, die für UV-Strahlung geeignet sind. 15.4 Elektrophoretische Auftrennung von Gesamt-RNA in denaturierenden Agarosegelen Während der elektrophoretischen Trennung wandert denaturierte RNA entsprechend ihrer molekularen Masse bzw. ihrer Länge. Dabei treten bei Nachweis mit Ethidiumbromid unter UV-Licht die ribosomalen 16S und 23S RNAs als diskrete Banden auf, deren Fluoreszenzintensität ein Verhältnis von 1:2 betragen sollte. Bei einer nicht verunreinigten und nicht degenerierten RNA-Probe sollten diese Banden deutlich zu erkennen und scharf begrenzt sein. Messenger-RNAs-Moleküle sollten aufgrund ihrer unterschiedlichen Längen diffus zwischen den Banden und unterhalb der 16S rRNA-Bande erkennbar sein. (Farrell, 1993) Präparation eines denaturierenden Agarosegels Gelkammer und Kamm mit RNase-Zap besprühen, einwirken lassen und mit RNase-freiem H2O abspülen 2,7 g Agarose in 130 ml RNase-freiem H20 aufkochen unter Rühren auf 80°C abkühelen lassen 18 ml 10-fach MOPS-Puffer und 32,4 ml filtriertes Formaldehyd zugeben das Gel in eine RNase-freie Gelkammer gießen nach dem Auspolimerisieren das Gel mit MOPS-Elektrophorese-Puffer überschichten Probenvorbereitung – 1-2 µl RNA mit dem zweifachen Volumen Ladepuffer versetzen – für 10 min bei 65 °C denaturieren und auf Eis abkühlen – 2,3 µl EtBr-Ladepuffer (2 µl Ladepuffer + 0,3 µl Ethidiumbromid) zugeben Elektrophorese den Gellauf bei einer Spannung von 80V solange dirchführen, bis das Bromphenolblau den unteren Bereich des Gels erreicht hat Gel ggf. unter UV-Licht scannen bzw. fotografieren 15.5 PCR-basierter Test auf DNA-Freiheit von RNA-Proben Um RNA-Eluate auf DNA-Verunreinigungen zu untersuchen, werden 2 µl der RNA-Probe als Template in einer PCR mit einem innerhalb des C. glutamicum Genoms bindenden Primerpaar (die erwartete Fragmentlänge sollte 500-1000 bp betragen) eingesetzt (vgl. Abschnitt III.11.2). Als Kontrolle dient dabei isolierte C.glutamicum Gesamt-DNA. Verunreingte RNA-Proben und die Kontrolle führen zu einem Amplifikat, während aus PCR-Reaktionen mit DNA-freien RNA-Proben kein PCR-Produkt resultiert. 16 Transkriptionsmessungen mit dem LightCycler (QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit Protocol, Qiagen) Die Transkriptionsstärke eines Gens kann per real time reverse transcription PCR (real time RT-PCR) mit dem LightCyler unter Verwendung des QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kits bestimmt werden. Dazu wird die Template-RNA zunächst durch Verwendung von zwei reversen Transkriptasen (Omniskript und Sensiscript) quantitativ in cDNA umgeschrieben. Durch eine 15 minütige Inkubation bei 95°C werden die reversen Transkriptasen inaktiviert und gleichzeitig eine „HotStart“ Taq-DNAPolymerase aktiviert. Sie amplifiziert ausgehend von spezifischen Primern und den entstandenen cDNA Template-Molekülen das zu untersuchende Gen. Der im Reaktionsansatz enthaltene Farbstoff SYBR Green I lagert sich dabei in die kleine Furche der entstehenden doppelsträngigen DNA-Moleküle. Die bei Anregung entstehende Fluoreszenz ist proportional zur Menge an entstehendem PCR-Produkt und kann mittels des Lightcyclers kontinuierlich während des gesamten PCR-Programms verfolgt werden. Mit Hilfe der LightCycler Software (Version 3.5) kann aus der Fluoreszenzsteigerung für jeden Reaktionansatz der sog. crossingpoint berechnet werden, der ein direktes Mass für die Ausgangsmenge an cDNA-Template bzw. an mRNA-Molekülen des zu untersuchenden Gens darstellt. Durch Vergleich der crossingpoints zweier Proben (P1 und P2) läßt sich so ein Faktor für die Transkriptionsstärken-Änderung des untersuchten Gens berechnen: X = 2(P -P ) 1 2 X: Faktor der Transkriptionsstärken-Änderung Eine crossingpoint-Differenz von 1 entspricht also einer zweifachen Verstärkung oder Abschwächung der Transkription, von 2 dem 4-fachen, von 3 dem 8-fachen etc. Mit dieser Methode läßt sich allerdings lediglich die Transkriptionsstärke eines einzelnen Gens in 2 verschiedenen Proben (z. B. nach Anzucht auf unterschiedlichen Medien oder zu unterschiedlichen Kultivierungszeitpunkten) bestimmen. Da nicht gewährleistet ist, dass 2 unterschiedliche Gene mit jeweils spezifischen Primern mit gleicher Effizienz von den cDNA-Templatemolekülen amplifiziert werden, können verschiedene Gene nicht direkt miteinander verglichen werden. Die entstehenden PCR-Produkte werden am Ende des RT-PCR-Programms durch eine vom Gerät automatisch durchgeführte Schmelzpunktanalytik überprüft. Ansatz für eine RT-PCR-Reaktion:
Der Reaktionansatz wird in die LightCycler-Kapillare pipettiert, mit dem dafür vorgesehenen Deckel verschlossen und kurz bei 3000 rpm anzentrifugiert. Anschließend können die Kapillaren in das Rotorkarussel gesteckt und der Lauf gestartet werden. LightCycler RT-PCR Programm
17 Extraktion von Proteinen 17.1 Herstellung von cytosolischen Proteinrohextrakten Für die Herstellung von Rohextrakten cytosolischer Proteine verschiedener C. glutamicum- bzw. E. coli-Stämme werden entsprechende Kulturen in Flüssigmedien bis zur gewünschten Wachstumsphase angezogen, gewaschen und in kleinem Volumen resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgt in einem RiboLyser (Hybaid). Hierbei werden die Bakterienzelle durch sehr stark beschleunigte Keramik- bzw. Silikatpartikel zerrieben. 10-45 ml (abhängig von der Zelldichte) einer Bakterienkultur werden für 10 min bei 6.000 rpm in einem JA17-Rotor abzentrifugiert das Pellet zweimal mit 30 ml Aufschlusspuffer waschen das Pellet in ca. 750 µl Aufschlusspuffer resuspendieren und in ein RiboLyser-Tube überführen 2 ml RNase/Dnase-Lösung zugeben und auf 5 min auf Eis vorkühlen die Zellen im RiboLyser zweimal 30 sec bei einer Geschwindigkeit von 6,5 m/sec aufschließen; dazwischen auf Eis abkühlen das Ribolysat 5 min auf Eis abkühlen die Zelltrümmer anschließend durch Zentrifugation für 30 min bei 15.000 rpm und 4°C pelletieren den Proteinrohextrakt als klaren Überstand in Eppis aliquotieren und bei -20°C lagern 17.2 Isolierung und Konzentrierung von Proteinen aus Überständen bakterieller Kulturen Zur Untersuchung derjenigen Proteine, die C. glutamicum in das umgebende Medium sekretiert, werden, die Zellen zunächst durch Zentrifugation vom Kulturüberstand abgetrennt werden. Für eine elektrophoretische Separation und eine Darstellung in Polyacrylamidgelen müssen die Proteine im Kulturüberstand dann 20 – 80-fach aufkonzentriert werden. Dazu wird eine Amicon Rührzelle verwendet, bei der durch Anlegen eines Überdrucks (5 bar) die proteinhaltige Lösung durch eine Ultrafiltrationsmembran aus regenerierter Cellulose gedrückt wird. Partikel, die gößer als die Porengröße der Membran (z. B. 10.000 Da) sind, werden zurückgehalten und verbleiben so in einem kleineren Volumen.
C. glutamicum Zellen werden in Minimalmedium MM1 bis zu einer OD.595 von 12 – 15 im Luftschüttler bei 30 °C und 150 rpm angezogen. die Zellen durch Zentrifugation für 40 min bei 8.000 rpm und 4 °C pelletieren den Kulturüberstand in einen neuen Zentrifugenbecher überführen und erneut abzentrifugieren den nun zellfreien Kulturüberstand in Aliquots (50 ml) in die Rührzelle überführen und durch Anlegen eines Überdrucks aufkonzentrieren vor dem Trockenfallen der Membran weiteren Kulturüberstand zugeben bis die gewünschte Konzentrierung erreicht wird Um höhere Konzentrationen zu erreichen, können im Anschluß an die Rührzelle zusätzlich Ultrafree BioMax Filtereinheiten benutzt werden. Diese besitzen eine senkrecht stehende Ultrafiltrationsmembran, durch die per Zentrifugation die zu konzentrierende Lösung gedrückt wird. Der Vorteil der Zentrifugationsfiltereinheiten im Vergleich zur Rührzelle besteht in einem deutlich geringeren Rest-oder Totvolumen, allerdings können mit ihnen nur deutlich kleinere Volumina (5-15 ml) aufkonzentriert werden. den Kulturüberstand (5 – 15 ml) in die entsprechende Filtereinheit pipettieren Zentrifugation bei 3.800 rpm und 4 °C bis die Lösung fast vollständig durch die Membran gedückt worden ist den Vorgang ggf. mehrmals wiederholen, den Filter dem zurückgebliebenen, konzentrierten Kulturüberstand spülen und in ein zur Aufbewahrung geeignetes Gefäß überführen 17.3 Aufreinigung Poly-His getaggter Proteine aus komplexen Gemischen Proteine die mit einem Affinitäts-Tag aus sechs hintereinader folgenden Histidinresten versehen sind, lassen sich schnell und effizient mit magnetischen Ni-NTA Agarosepartikeln aus einem komplexen Proteingemisch aufreinigen. Bei den verwendeten Partikeln handelt es sich um Agarose-Kügelchen in die magnetische Teilchen eingeschlossen und an deren Oberfläche stark Metallionen chelatierende Nitrilotriessigsäure-Gruppen (nitrilotriacetic acid, NTA) kovalent gebunden sind. Diese Gruppen sind mit Nickel-Ionen beladen und können direkt für die Bindung von 6 x His getaggten Proteinen unter nativen und denaturierenden Bedingungen eingesetzt werden
Abb. III.03: Schematische Darstellung der Bindung von zwei Histidinresten an die Ni-NTA-Gruppe eines Agarosepartikels. Mit Hilfe eines Magneten können die Partikel inklusive des gebundenen Proteins aus der Proteinlösung separiert werden. Nach mehreren Waschschritten kann das getaggte Protein schließlich durch Erniedrigung des pH-Wertes oder durch Verdängung mit Imidazol von den magnetiswchen Ni-NTA Agarosepartikeln eluiert werden. Ni-NTA Magnetic Beads durch vortexen für 2 sec gründlich resuspendieren 300 µl der Suspension in einem Eppi mit 1 ml der Proteinlösung (z. B. konzentriertem Kulturüberstand) vermischen (100 µl der 5% NI-NTA Magnetiv Bead Suspension binden 30 µg des 24 kDa DHFR Proteins) die Suspension unter ständiger Bewegung im Roller für 30 min – 1h bei 4°C inkubieren das Eppi für 1 min in den Magnet-Separator stellen und den Überstand vorsichtig und möglichst vollständig mit einer Pipette abziehen. 500 µl Waschpuffer zugeben, gründlich vermischen, die Beads erneut durch den Magneten abtrennen und den Überstand verwerfen diesen Waschschritt 1 – 2 mal wiederholen 100 µl Elutionspuffer zugeben, die Suspension gründlich vermischen und die Beads separieren das Eluate vorsichtig mit einer Pipette abziehen und in neues Eppi überführen 17.4 Bestimmung des Proteingehaltes (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad) Die spektrophotometrische Bestimmung des Proteingehaltes einer Lösung mit Hilfe des Bio-Rad Protein Assays basiert auf der Proteinbestimmung nach Bradford (1976). Diese Methode macht sich die Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G250 nach Bindung an basische und aromatische Aminosäurereste von Polypeptiden mit einer molekularen Masse von mehr als ca. 3 kDa zunutze. 200 µl Bio-Rad Reagenz, 700 µl H2O bidest und 100 µl Proteinlösung (Rohextrakt ca. 1:200 verdünnt) in einem Eppi mischen 5 min Inkubation bei Raumtemperatur die Lösung in eine Küvette überführen und die OD595 gegen einen Leerwert (100 µl des jeweiligen Puffers statt der Proteinlösung) messen 18 Trennung und Visualisierung von Proteingemischen Die Trennung von Proteingemischen erfolgt durch den Einsatz von Polyacrylamidgelen. Dabei können Proteine aufgrund charakteristischer Eigenschaften, z. B. ihres Molekulargewichtes oder ihres isoelektrischen Punktes, getrennt werden. Die Visualisierung der Proteine kann durch Färbung mit Coomassie Brilliant Blue erfolgen, die es erlaubt, die Proteine anschließend in weiteren Analysen, z. B. der Massenspektrometrie, zu verwenden.
18.1 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (nach Laemmli, 1970)
Durch diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) können Proteine unter denaturierenden Bedingungen in Abhängigkeit von ihrer Größe aufgetrennt werden. Die größenabhängige Wanderung der Proteine im elektrischen Feld wird durch in den Puffern sowie in der Gelmatrix enthaltenes SDS ermöglicht. SDS bindet in einem konstanten Verhältnis an die aufzutrennenden Proteine (ca. 1,4 g SDS pro 1 g Protein), wodurch diese in Abhängigkeit von ihrer Molekülmasse eine gleichmäßige negative Ladung erhalten. Die Eigenladung der Proteine wird durch die Anlagerung großer Mengen SDS vernachlässigbar. Zusätzlich führt SDS als anionische Detergenz zur Auflösung von Tertiär- und Quartärstrukturen. Zusätzlich im Probenpuffer verwendetes Dithiothreitol (DTT) reduziert intra- und intermolekulare Disulfidbrücken. Die negativ geladenen Protein-SDS-Komplexe wandern im Polyacrylamidgel zur Anode. Die Auftrennung des Proteingemisches erfolgt umgekehrt proportional zum Logarithmus des Molekulargewichtes. Diskontinuierliche Gelsysteme nach Laemmli (Laemmli et al. 1970) bewirken durch Verwendung unterschiedlicher Acrylamid- und Ionenkonzentrationen eine Konzentrierung der Proteinproben am Übergang zwischen Sammel- und Trenngel, wodurch eine höhere Trennschärfe erreicht sowie eine Aggregation und Präzipitation der Proben während des Eintritts in die Gelmatrix verhindert wird. Die Konzentration des eingesetzten Acrylamids und die durch N-N'-Methylenbisacrylamid erreichte Quervernetzung bestimmt die Porengröße des Trenngels. Um Proteine mit geringem Molekulargewicht auftrennen zu können, werden Gele mit hoher Acrylamid-Konzentration verwendet. Zur Bestimmung des Molekulargewichtes unbekannter Proteine werden zusätzliche Referenz-Proteine mit bekannter Molekülmasse aufgetragen. Herstellung von diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamidgelen: die benötigten Lösungen können bei 4°C gelagert werden, Ammoniumpersulfatlösung (APS) muß frisch angesetzt werden die Gelkammer mit Hilfe der entsprechenden Klammern zusammenbauen und senkrecht aufstellen die Trenngellösung mit der gewünschten Acrylamidkonzentration frisch ansetzen die Gellösung mit einer Spritze bis ca. 1 cm unterhalb des oberen Randes in die Gelkammer einfüllen das Gel sofort mit ca. 1,5 ml wassergesättigtem 1-Butanol überschichten und mindestens für 1 h auspolymerisieren lassen, anschließend das Butanol abgießen die Sammelgellösung frisch ansetzen, auf das Trenngel füllen den Kamm einsetzen und das Gel für mindestens 15 min auspolymerisieren lassen Tab. III.11: Zusammensetzung von Lösungen unterschiedlicher Acrylamidkonzentrationen für Trenngele bei der 1D-SDS-PAGE.
APS 10 % (w/v) 30 µl 30 µl 30 µl 30 µl 30 µl Trenngel (nach Minigel G41 Manual, Biometra) Tab. III.12: Zusammensetzung des Sammelgels für die 1D-SDS-PAGE.
Sammelgel (nach Minigel G41 Manual, Biometra): Probenvorbereitung und Gellauf: – die Proben dem Proteingehalt entsprechend verdünnen und in einem Verhältnis von 5:1 mit 5-fach Probenpuffer mischen – das Gel mit entsprechenden Klammern in die Laufkammer einbauen – Laufpuffer in den oberen und unteren Pufferbehälter einfüllen – den Gelkamm ziehen und die Taschen mit Laufpuffer ausspülen die Proteinproben mit dem Probenpuffer direkt vor dem Auftragen 2 min aufkochen und anschließend auf Eis abkühlen, kurz abzentrifugieren die Proben mit einer 10 µl Pipette in die Geltaschen einfüllen (ca. 10 µl) die Elektrophorese erfolgt bei 15 bis 40 mA und ca. 180 V, bis das im Ladepuffer enthaltene Bromphenolblau den unteren Gelrand erreicht hat nach dem Lauf das Gel aus den Glasplatten entnehmen und für die Coomassie-Färbung in eine Färbeschale überführen 18.2 Zweidimensionale Gelelektrophorese (Klose, 1975; O'Farrell, 1975; 2D-Electrophoresis Manual, Amersham Pharmacia Biotech) Die Trennung komplexer Proteingemische kann auch durch zweidimensionale Gelelektrophorese (2D-PAGE) erfolgen. Dabei werden die Proteine zunächst in der ersten Dimension nach ihren isoelektrischen Punkten (pI) und in der zweiten Dimension nach anhand ihrer Molekülmasse (MW) aufgetrennt. Die isoelektrische Fokussierung (IEF) der Proteine erfolgt in einem Polyacrylamidgel mit immobilisiertem pH-Gradienten (IPG-Strip) unter Verwendung hoher Harnstoff-Konzentrationen, des nicht-ionischen Detergenz CHAPS sowie des Reduktionsmittels DTT unter denaturierenden Bedingungen. Die Mobilität der Proteine im pH-Gradienten ist dabei von ihrer Nettoladung abhängig. Vor der isoelektrischen Fokussierung wird der Protein-Rohextrakt mit Aceton gefällt, um restliche Salze zu entfernen und die Probe im entsprechenden IEF-Puffer aufzunehmen. Nach der isoelektrischen Fokussierung wird das IPG-Gel mit den darin enthaltenen Proteinen equilibriert. Durch die Alkylierung von Thiolresten unter Verwendung von Iodoacetamid wird dabei eine Oxidation von Cysteinresten verhindert. Die durch die Equilibrierung erzeugten SDS-Protein-Komplexe ermöglichen eine Auftrennung der Proteine in der zweiten Dimension anhand ihrer Molekülmasse in einer SDS-PAGE mit einem 12-14 % Acrylamid-Gradientengel.
Acetonfällung: - 400 µl Proteinextrakt mit 1,6 ml gekühltem (-20°C) Aceton in einem 2 ml Eppi vermischen - die Proteine mindestens 4 h oder ü/N bei -20°C fällen - 30 min Zentrifugation bei 15.000 rpm und 4°C, den Überstand anschließend verwerfen - das Pellet mit 1 ml gekühltem (-20°C) Aceton waschen, 5 min Zentrifugation bei 15.000 rpm - den Überstand vollständig abziehen und das Proteinpellet an der Luft trocknen - das Proteinpellet für 1 h bei Raumtemperatur in 400 µl Rehydration Buffer (RB) rehydrieren - anschließend muß der Proteingehalt im Rehydrationbuffer bestimmt werden Isoelektrische Fokussierung (IEF): die IPG-Strip-Holder mit Detergenz und H2O bidest. reinigen und anschließend trocknen die gewünschte Proteinmenge (300 bis 500 µg Protin pro Gel) aus der Acetonfällung in 500 µl Rehydration Buffer (RB) resuspendieren 450 µl der Proteinlösung mit 2,5 µl IPG-Puffer und 5µl DTT-Lösung versetzen die Lösung gleichmäßig in einem IPG-Strip-Holder verteilen den Schutzfilm vom IPG-Strip entfernen den Strip mit der Gelseite nach unten luftblasenfrei in korrekter Orientierung auf die Lösung im Strip-Holder legen, das Gel muss vollständig mit der Lösung in Kontakt sein den IPG-Strip vollständig mit ca. 1-2 ml IPG Cover Fluid bedecken – den Strip-Holder verschließen und in korrekter Orientierung auf die IPGphor (Amersham Pharmacia) legen, das IEF-Programm mit maximal 50 µA pro aufgelegtem IPG-Strip starten: | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
