Scientific
Publications - Work Done by Microbiology Reader Bioscreen C
INFLUENCIA DE DIFERENTES MEDIOS
DE CULTIVO SOBRE LA DINÁMICA DE
CRECIMIENTO, LA NODULACIÓN Y LA SÍNTESIS DE FACTORES DE
NODULACIÓN EN DOS CEPAS DE B. ELKANII.
María Caridad Nápoles García1,
Daimy Costales Menéndez1, Ellen
Luyten2, Bruno
Dombrecht2,
Ellen Somers2 y Jos Vanderleyden2.
1.
Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). La Habana, Cuba.
2. Centro de
Microbiología y Genética Vegetal (CMPG). Leuven. Bélgica.
Email:
tere@inca.edu.cu
INTRODUCCIÓN
Indudablemente, el uso de las leguminosas como
fuente de fibras y alimentos continuará
incrementándose en el futuro.
Las especies colectivamente
denominadas como rizobios son conocidas por su relación
simbiótica con las plantas
de leguminosas. En los últimos años, la investigación ha permitido
desentrañar
importantes mecanismos que regulan la simbiosis entre la
soya y
Bradyrhizobium.
El mejor conocimiento
de la ecología de los microorganismos, asociado a aspectos
tecnológicos
de producción de inoculantes de mejor calidad, permitirán
optimizar la
utilización del fenómeno de fijación de nitrógeno, con
beneficio para los productores y para
la sostenibilidad de los sistemas agrícolas, en
los que la soya participa. Se conoce por
ejemplo que los flavonoides
pueden causar inducción de los genes nod a
concentraciones
en el rango micromolar y nanomolar, los agrónomos pudieran
manipular el efecto de estos
compuestos mediante su aplicación directa,
seleccionando combinaciones de cepas-
hospederos que estimulen el
incremento en la síntesis y liberación de los inductores. Como
resultado de ello
podría incrementarse la nodulación, la fijación del nitrógeno
y los
rendimientos del grano (Mariangela Hungria y Stacey, 1997).
Cada
organismo requiere encontrar en su medio todas las sustancias
necesarias para la
generación de energía y la biosíntesis celular. Los
elementos de ese medioambiente que
son
utilizados
para
el
crecimiento
celular
se
refieren
como
nutrientes
(http://www.bact.wisc.edu/Bact303/NutritionandGrowth). El diseño de un
medio de cultivo
responderá entonces a las exigencias del microorganismo en
cuestión y a la finalidad que
se persigue con su reproducción. Nos corresponde a los
investigadores diseñar y orientar
nuevos medios de cultivo que permitan obtener
inoculantes cada vez más efectivos, inocuos
y asequibles. En este trabajo se
estudia el efecto de diferentes medios de cultivo sobre el
crecimiento celular, la
nodulación y la capacidad de fijación de nitrógeno de dos cepas de
B.
elkanii.
MATERIALES Y MÉTODOS
Como material microbiano se
emplearon las cepas Bradyrhizobium elkanii ICA 8001 y
LMG 6134.
Las mismas fueron cultivadas en los diferentes medios en condiciones de
agitación a
30 °C. Se
utilizaron los siguientes medios de cultivo:
Medio Manitol Extracto de
Levadura (YEM) (Vincent, 1970)
Medio de Propagación (Mirtha López y cols.
1990) Medio
Bradyfact (Patente No. 22 797)
Determinación
de la dinámica de crecimiento celular.
Las cepas se crecieron durante 3
días a 30 ºC y en condiciones de agitación en medio YEM.
Los precultivos se diluyeron en
MgSO4 10 mM hasta un valor de densidad
óptica a 595 nm
de 0.3 (dilución aproximada de 10 veces;
espectrómetro lamba 2, Perkin Elmer, UV/VIS).
Subsecuentemente, los inóculos
conteniendo el mismo número de bacterias, se diluyeron
100 veces en los
diferentes medios de cultivo bajo estudio y 300 m L
de cada una de las
suspensiones bacterianas se inocularon en los pozos
de una placa micro título. Las
bacterias se cultivaron a 30 ºC
durante 6 días y su crecimiento fue medido automáticamente
cada 30 minutos en un Bioscreen C
(Labsystems OY) a una longitud de onda de 600 nm.
Para el estudio
de la nodulación se utilizó un experimento con diseño
completamente
aleatorizado, en el cual se emplearon semillas de
soya de la variedad “William 82”. Las
semillas pregerminadas fueron
plantadas en frascos de 500 ml de volumen que contenían
medio Norris y Date semisólido
(Norris y Date, 1976). Las raíces de las plántulas se
inocularon con 200 µl
de los inóculos obtenidos en los diferentes medios de cultivo. Las
plantas se
crecieron en un cuarto de crecimiento con 12-h de fotoperíodo, a una temperatura
día/noche de
26ºC/22ºC y humedad relativa del 70 %, según se describe por
Michiels y
colaboradores (1998b). Cuatro semanas después de la inoculación, se determinó el
número de
nódulos por planta, así como la capacidad de fijación de nitrógeno mediante el
ensayo de
reducción del acetileno empleando un cromatógrafo de gas(5890 A;
Hewlett-Packard,
equipado con una columna de CHROMPACK “PLOT.
Marcaje
radioactivo y detección de metabolitos Nod mediante cromatografía de fase
reversa:
Los factores de nodulación fueron marcados
radioactivamente y aislados siguiendo la
metodología descrita por
Laeremans y cols., 1998. 100m L de los cultivos de
Bradyrhizobium
elkanii
(cepas ICA 8001 y LMG 6134) cultivados durante 50 horas en medio YEM a 30°C, se
inocularon en 900m L de cada medio de cultivo a
estudiar y se ajustó la concentración hasta
un valor de densidad óptica de
0.1 a una longitud de onda de 600 nm, aproximadamente
5x108
UFC. Se realizó el marcaje isotópico añadiendo 125
m L de ácido acético 14C
[2-14C]
en forma de
sal de sodio. Las células se sometieron a marcaje durante 36 horas. Los factores
de
nodulación producidos se aislaron dos veces por extracción con 500m L
de n-butanol y se
lavaron por centrifugación con acetato de etilo durante
cuatro veces. La solución se secó al
vacío y las muestras se disolvieron en 10m L
de metanol al 70 % para ser aplicadas sobre
placas TLC de fase reversa
(RP-18 F 254, Merck). Se utilizó
como fase móvil la mezcla
agua/acetonitrilo (1:1, vol./vol.). La radioactividad se
visualizó por autorradiografía, utilizando
filmes del tipo Hyperfilm- b
max (Amershan Life Sciences) después de cuatro días de
exposición en la oscuridad
a temperatura ambiente.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Al evaluar la dinámica de
crecimiento de las cepas B. elkanii ICA 8001 y LMG
6134 frente a
los medios YEM, Propagación y Bradyfact, se obtienen
curvas de crecimiento muy bien
diferenciadas y con resultados muy superiores de
crecimiento celular cuando se emplea el
medio Bradyfact(Figura No. 1).
Para ambas
cepas el medio de propagación supera en número de bacterias obtenidas
al medio
YEM aunque el comportamiento de la dinámica en el tiempo fue muy
similar para
ambos medios.
Se evidencia un comportamiento muy similar de la cepa
6134 al presentado por la ICA 8001
frente a todos los medios, aunque esta cepa de
referencia creció más rápido que la 8001 en
los tres medios ensayados.
Las ventajas del
empleo del nuevo medio Bradyfact en cuanto a la obtención de mayor
número de
células son evidentes, lo que refleja el efecto positivo de los
componentes
introducidos en este medio sobre la fisiología del
microorganismo. La soya como fuente de
carbohidratos, proteínas y otros
elementos (Huisman, Schols y Voragen, 1998), al parecer
suministra una buena cantidad de
nutrientes que garantizan un elevado desarrollo celular. El
aporte de la melaza
en azúcares fundamentalmente, pero también en proteínas,
aminoácidos y
vitaminas (Biart, Serrano y Conde, 1982) ayudan como complemento
nutritivo.
El nuevo
medio Bradyfact evidencia su superioridad no sólo para la cepa ICA
8001,
igualmente se diferencia positivamente del resto de los medios con una cepa de
referencia
internacional. Otras cepas simbiontes de soya como B.
japonicum E109 de Argentina y B.
elkanii
SEMIA 5019 de Brasil, muestran igual crecimiento superior
cuando son cultivadas en
este medio(resultados no mostrados).
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
2,00
Tiempo
I/8001
I/6134
II/8001
II/6134
III/8001
III/6134
Leyenda: I: medio Propagación
II: medio Bradyfact III: medio YEM
Figura No. 1. Dinámica de
crecimiento de las cepas ICA 8001 y 6134 en los diferentes
medios de cultivo.
Los
resultados de la influencia de los diferentes medios de cultivo sobre la
nodulación y su
efectividad se muestran a continuación.
Tabla No. 1. Efecto de
diferentes medios de cultivo sobre la nodulación de la cepa ICA 8001.
Medio de cultivo
No.
nódulos.pta-1
ARA(µmoles etileno.pta-1.h-1)
YEM
20.3 b
0.18 b
Propagación
26.6 ab
3.03 b
Bradyfact
35.3 a
7.12 a
ESx
2.61*
1.09**
Valores seguidos por la misma
letra no difieren significativamente.
Esx: * significa P<0.05 **P<0.01
Además del mayor número de
nódulos que se obtiene con el empleo del medio Bradyfact es
importante señalar la alta
efectividad de los nódulos desarrollados en este tratamiento, los
cuales duplican los
micromoles de etileno producidos como expresión de fijación de
nitrógeno en el
medio Propagación y mucho más al medio YEM.
La síntesis de
los factores de nodulación por ambas cepas también mostró un
comportamiento diferenciado cuando éstas fueron cultivadas en diferentes
medios(Figura
No. 2).
Cuando se cultiva la cepa ICA 8001 en el medio Propagación
se obtienen 2 manchas tenues
correspondientes a factores Nod sintetizados y excretados
por la cepa, mientras que en el
medio Bradyfact esta cepa es capaz de producir entre
4 y 6 lipoquitinoligosacáridos
diferentes parcialmente definidos por cromatografía.
En el caso
de B. elkanii LMG 6134 el número de factores Nod
producidos fue menor que con
la 8001. El medio tradicional de Propagación
apenas muestra producción de estos
metabolitos Nod, pero el medio
Bradyfact presenta una mancha clara e intensa y otras dos
estructuras en menor
concentración.
Figura No. 2. Perfil de
factores Nod producidos por B. elkanii ICA
8001 y B. elkanii LMG
6134 ante los medios de cultivo
Propagación y Bradyfact.
Para ambas cepas Bradyfact
supera al medio Propagación además de en su crecimiento
celular, en la inducción de
la producción de factores de nodulación.
REFERENCIAS
1. Biart, J. R.
Serrano and J. Conde. Study of sugar cane final molasses. Editorial
Científico-técnica.
C. Habana. Cuba. 1982.
2. Huisman, M. M. H. A. Schols, and A. G. J.
Voragen. Cell wall polysaccharides
from soybean (Glycine max.)
meal. Isolation and characterization. Carbohydr
Polymers 37: 87-95. 1998.
3. Laeremans, T.
/et al./. Functional redundancy of genes for sulphate
activation
enzymes in Rhizobium sp. BR 816. Microbiology, 143: 3933-3942. 1998.
4. López Mirtha
et al. Manual de Tecnologías de Producción del
biofertilizante Bio-
Rhizo. La Habana: Empresa Cubana de Productos Veterinarios
Cuba-Vet.
Instituto de Ciencia Animal, Instituto de Investigaciones Pastos y Forrajes.
1990. 5.
Mariangela Hungria and G. Stacey, Molecular signals exchanged between
host plants
and rhizobia: basis aspects and potential application in agriculture.
Soil Biol.
Biochem. 29: 819-830. 1997.
6. Michiels, J., M. Moris, B. Dombrecht, C. Verreth, and
J. Vanderleyden. Differential
regulation of Rhizobium etli
rpoN2 gene expression during symbiosis and free-
living growth. J Bacteriol
180:3620-3628. 1998b.
7. Norris, D.O. and Date, R.A. Legume bacteriology
Tropical Pasteur Research.
Principles and Methods. C.A.B. Bill 51:134-174. 1976.
8. Patente No. 22
797. Concedido por resolución No. 556/2002. OCPI. Cuba.
9. Todar,
K.
2001.
Nutrition
and
Growth
of
bacteria.
http://www.bact.wisc.edu/Bact303/NutritionandGrowth
10.
Vincent, J.M. A manual for the practical study of root-nodule
bacteria/J.M.
Vincent.-En: International Biological Programme
Handbook. No. 15. Blackwele
scientific publications, Oxford, England. 1970.
Propag. Bradyf
Cepa ICA 8001
Propag. Bradyf
Cepa LMG 6134
(Full Text online - PDF)
