Scientific Publications - Work Done by Microbiology Reader Bioscreen C

Technische Universität München, Forschungszentrums für Milch und Lebensmittel Weihenstephan, Institut für Mikrobiologie, Research Abstracts, pp. 91-127

Adaptation von Reifungskulturen an sauren pH

(Ger.) [Acid adaptation of cheese ripening strains]

Kinga Kiss, Barbara Silakowski, Siegfried Scherer

Institut für Mikrobiologie

Adresse     Weihenstephaner Berg 3

D- 85354 Freising-Weihenstephan

Telefon: 08161-71-3516 Telefax: 08161-71-4492

Home page: http://www.weihenstephan.de/micbio

Personal

Der Institutsleiter ist zugleich Professor für Mikrobielle Ökologie am Department für Biowissenschaftliche Grundlagen. Das Lehrgebiet wurde von der Fakultät weder mit Stellen noch mit Mitteln ausgestattet. Diese Mitarbeiter werden aus Drittmitteln bezahlt.

Forschung:

Arbeitsgruppe:

Genomische Studien an Salmonellen Gruppenleiter: Thilo M. Fuchs

Die Enteritis-Salmonellosen des Menschen gehören zu den bedeutendsten Infektionskrank­heiten des Gastrointestinaltraktes. Sie werden durch eine Vielzahl verschiedener Salmonellen verursacht, die in der Regel vom Tier auf den Menschen übertragen werden. Obgleich die meisten Salmonellen ihren originären Standort vorwiegend bei verschiedenen landwirtschaft­lich genutzten Tierarten besitzen, persistieren sie dort oft subklinisch bzw. symptomlos und lösen erst beim Menschen Gastroenteritis aus.

Unser zunehmendes Wissen über die molekularbiologischen Mechanismen, die einer Salmo­nella-Infektion zugrunde liegen, wird in Zukunft eine verbesserte Bekämpfung der Enteritis-Salmonellosen ermöglichen. Es kann sogar daran gedacht werden, durch gezielten Knockout an der Virulenz beteiligter Gene („Attenuation“) einen Salmonellen-Stamm zu erzeugen, der als Impfstoff-Träger eingesetzt wird. Dabei dient der nicht mehr krankheitsauslösende Salmo­nella-Stamm als Vehikel, um das Antigen eines anderen Bakteriums oder Virus in die Nähe von Zellen des Immunsystems zu bringen.

Allerdings haben die in den vergangenen Jahren durchgeführten Sequenzierungen bakterieller Genome ein überraschendes Ergebnis zu Tage befördert: je nach Organismus können 20-40% der gefundenen Genen bislang keine Funktion zugeordnet werden. Das bedeutet, dass einige zelluläre Mechanismen nur unzureichend charakterisiert sind oder bislang vollständig unbe­kannt sind.

Wir stellen im folgenden zwei Beispiele dafür vor, wie für eine große Zahl dieser Gene eine vorläufige Funktionszuordnung durchgeführt werden kann, der dann in ausgewählten Einzel-fällen eine detaillierte Charakterisierung folgt.

“Screening” des Salmonela-Genoms nach Genen, die zum intrazellulären Überleben und Wachstum beitragen

Screening the Salmonella genome for genes contributing to intracellular survival and growth

Thilo M. Fuchs, Heide Niesalla, Elke Freissler, Jochen Klumpp et al.

Wir entwickelten einen neuen „Screening“-Ansatz, um solche Gene zu identifizieren, die an der intrazellulären Vermehrung von Salmonella enterica serovar Typhimurium beteiligt sind. Dieser Ansatz umfasst (i) ein genetisches System, das auf dem Prinzip der homologen Re­kombination basiert und zur genomweiten insertionalen Mutagenese eingesetzt wird, und (ii) ein Hochdurchsatz-Verfahren, mit dessen Hilfe solche Mutanten isoliert werden, die sich bei der Infektion von Makrophagenzellen als attenuiert (abgeschwächt) herausstellen. Dazu wur­den kurze, chromosomale Fragmente in einen temperatursensitiven Vektor kloniert; durch insertionale Duplikationsmutagenese, gefolgt von einem Selektionsschritt bei nicht permissiver Temperatur, wurden 9125 individuelle Mutanten erzeugt (Abb. 1).

37 °C

Abb. 1: Mutagenese durch insertionalen Knockout. Chromosomale Fragmente, die kürzer sind als ein durchschnittliches Gen, werden in einen Vektor kloniert, der bei 37°C nicht mehr replizieren kann. Die Integration des kompletten Vektors und damit die insertionale Mutagenese erfolgt ortsspezifisch über homologe Rekombination.

Wir wollten nun wissen, welche Gene am Überleben und der Replikation von S. typhimurium in Makrophagenzellen, die eine wichtige Zwischenstation bei einer Infektion sind, beteiligt sind. Dazu ersetzten wir den Infektionsassay mit Makrophagen im 24-Well-Format durch ein Hochdurchsatzverfahren in Mikrotiterplatten. Zusätzlich wurde die Zahl der nach der Infektion überlebenden Zellen nicht durch arbeitsaufwendiges Ausplattieren und Auszählen der Bakte­rien bestimmt, sondern durch die Messung der optischen Dichte der jeweiligen Zelllysate im ELISA-Reader. Die Korrelation zwischen beiden Verfahren zeigt die Abbildung 2.

Abb. 2: Die Überlebensrate verschiedener S. typhimurium -Mutanten in Makrophagen-Zellen. Um nach erfolgter Zelllyse die Zahl der überlebenden Bakterien quantitativ zu erfassen, bieten sich zwei Verfahren an, nämlich die OD-Messung (oben) und das aufwendigere Ausplattieren der Lysate (unten). Beide Verfahren korrelieren in qualitativer Hinsicht miteinander. Deutlich erkennbar ist die geringere Überlebens-rate der eingesetzten Stämme im Vergleich zum Wildtyp. Die Knockout-Mutante des Regulatorgens phoP ist dabei stärker attenuiert als die aroA- oder sseC­Mutante. Während AroA am zellulären Metabolismus beteiligt ist, handelt es sich bei dem von sseC codierten Protein um ein sekretiertes Protein.

Dieser neuartige Makrophagen-Infektionsassay erlaubte uns die Testung aller 9125 Mutanten, von denen 438 Klone in ihrer intrazellulären Replikationsfähigkeit stark beeinträchtigt waren. Diese Mutanten wurden mittels PCR-Amplifikation des ursprünglichen Fragmentes und des-sen anschließender Sequenzierung weiter charakterisiert. Dazu wurde eine Genomkarte von Salmonella typhimurium erstellt, in der bereits bekannte Virulenzfaktoren, darunter die sog. Pathogenitätsinseln, mit den von uns identifizierten Genen abgeglichen wurde. Wir definier-ten schließlich eine Reihe von möglichen neuen Faktoren, die am intrazellulären Überleben von Salmonella Stämmen maßgeblich beteiligt sind, unter ihnen solche, deren Funktion bis-lang unbekannt war. Die Abbildung 3 zeigt die funktionale Gliederung dieser Gene, die nach einem Knockout zur Attenuierung von S. typhimurium führen können.

Abb. 3: Gruppierung der identifizierten Salmonella-Gene, die nach insertionalem Knockout zur Attenuierung geführt haben. Die Mehrzahl der Gene fällt in die Kategorien Transport, Metabolismus und Regulation. Für etwa 30% der identifizierten Sequen­zen konnten wir keine Homologie zu Proteinen anderer Bakterien feststellen. Es handelt sich hier vermutlich um Faktoren, die spezifisch an der Salmonellen-Virulenz Anteil haben.

In der Folge werden wir aus der Vielzahl an gefundenen Genen einige auswählen und zu-nächst durch sog. „In-frame-Deletionen“ validieren. Hierbei interessieren uns vor allem “hot-spots”, also Regionen im Salmonella-Genom, in denen attenuierende Gene in enger Nachbar­schaft liegen. Durch den Vergleich mit Daten anderer pathogener Organismen wie Listerien wollen wir ein genaueres Bild der Vorgänge bei der intrazellulären Replikation dieser Bakte­rien zeichnen.

Genomische Mutagenese eines Gram-negativen Bakteriums: Definition des Sets der es­sentiellen Gene von Salmonela

Genomic mutagenesis of a Gram negative bacteria: Definition of a set of essential genes in Salmonella

Thilo M. Fuchs, Karin Knuth et al.

Das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung einer genomweiten Mutantenbank wurde von uns in eine Strategie zur Identifikation essentieller Gene integriert. Unter essentiellen Genen verstehen wir Gene, die auch unter Laborbedingungen für das Bakterium nicht ver­zichtbar sind und daher auch nicht mutagenisiert werden können. Solche Gene sind generell Zielpunkte für Antibiotika. Diese Strategie beinhaltet i) die genannte Knockout-Mutagenese,

ii) das „Screening“ einer kompletten Mutantenbank nach lethalen Insertions-ereignissen, und

iii)             die Identifikation geeigneter und neuer antibakterieller Targets.

Die in einem konditional replizierenden Vektor vorliegende Fragmentbank wurde in S. typhimurium transformiert; die unter permissiven Bedingungen kultivierten Transforman­ten wurden vereinzelt und als Referenzbank gesichert. Eine im 96-Well-Format vorliegende Kopie dieser Bank wurde anschließend unter nicht-permissiven Bedingungen selektioniert. In diesem Schritt überlebten nur solche Klone, bei denen a) ein Rekombinationsereignis einge­treten war und b) dieses Rekombinationsereignis keine lethalen Folgen für den betroffenen

Klon hatte. In den Fällen, in denen aufgrund der insertionalen Rekombination keine überle­bensfähigen Bakterien auffindbar blieben, waren offenbar essentielle Gene betroffen (Abb. 1).

Abb. 1: Eine Referenzbank, bestehend aus Klonen von S. typhimurium mit frei replizieren-dem Vektor als Träger einer Fragmentbank, wurde im 96-Well-Format erstellt. Wachstum der Einzelklone unter nicht-permissiven Bedingungen, unter den der Vektor nicht mehr replizieren kann, führt zur Selektion von Insertionsmutanten (grau). Klone, bei denen die Insertion über homologe Rekombination lethal ist, deuten auf klonierte Fragmente hin, die Teil essentieller Gene sind (weiß).

Etwa 500 solcher wachstumsdefizienter Mutanten wurden identifiziert. Durch Rückgriff auf die Referenzbank konnten die jeweiligen Fragmente amplifiziert und anschließend sequen­ziert werden. Die erhaltenen Sequenzen wurden mittels BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)-Analyse nach Homologien zu bereits bekannten Genen untersucht. Ergebnis dieser Arbeit war eine genomische Mappe lethaler Insertionsmutanten (Abb. 2).

Abb. 2: Ausschnitt aus der Genomkarte von S. typhimurium. Die dunklen Pfeile stellen be­reits bekannte essentielle Gene dar, durch das Verfahren der Insertionsmutagenese identifizierte Fragmente, die Teile essentieller Gene sind, sind als kurze Pfeile den Genen unterlegt. Die hier gezeigte Region umfasst das Gencluster der Murein-Biosynthese. Einige Antibiotika wie Bacitracin oder Ampicillin sind gegen die Zellwandsynthese und damit gegen die Funktion der Gene der Murein-Biosynthese gerichtet.

Aus den ermittelten Fragmenten leiteten wir etwa 220 Gene ab; diese Gene machen schät­zungsweise die Hälfte aller für S. typhimurium essentiellen Gene aus. Darunter findet sich eine Vielzahl von Genen, die für Proteine unbekannter Funktion codieren. Um aus der Gesamtgruppe die vielversprechendsten antibakteriellen Zielmoleküle herauszufiltern, wendeten wir ein Validierungsschema an, das die Verbreitung der Gene in anderen, medizinisch relevanten Bakterien untersuchte. Wir erhielten als Ergebnis ein Muster orthologer Proteine, die teilweise nur in einer oder wenigen Spezies vorkommen, teilweise in den meisten der untersuchten Pa­thogenen gefunden werden konnten (Abb. 4). Die identifizierten „Targets“ können direkt zur Wirkstoffentwicklung eingesetzt werden.

Abb. 3: Essentielle Proteine von Salmonella aus unserem Ansatz, die nach den Kriterien Löslichkeit und fehlende Homologie zum Humangenom ausgewählt wurden. Die Aminosäuresequenzen wurden anschließend mit den Proteinen medizinisch rele­vanter Bakterien verglichen. Je nach Homologiegrad eignen sich die einzelnen Tar­gets zur Entwicklung von Spezies-spezifischen oder Breitband-Antibiotika.

Arbeitsgruppe:

Molekularbiologie von Bakteriophagen Gruppenleiter: Martin J. Loessner

Listeria monocytogenes ist ein opportunistischer Infektionserreger, welcher vor allem für Un­geborene, Kleinkinder, Schwangere, ältere Menschen und Personen mit geschwächtem Im­munsystem gefährlich sein kann. Der Keim ist in der Lage, die Blut-Hirn Schranke und die Plazenta-Barriere zu überwinden und kann sowohl Meningiten diaplazentare Foetus-Infektionen verursachen. Listerien werden meist oral mit der Nahrung aufgenommen und kommen in Lebensmitteln häufig vor, besonders in solchen tierischer Herkunft. Speziell Milchprodukte wie verschiedene Weichkäse, rohe und fermentierte Fleischwaren, Geflügel, aber auch Feinkostwaren, Salate und Cremespeisen sind häufig (bis zu 50%) mit Listeria kontaminiert.

Clostridium perfringens ist ein gram-positiver, anaerober Sporenbildner welcher ubiquitär vorkommt und mit einfachen Mitteln aus Sedimenten und (insbesondere fäkal verunreinigten) Böden isoliert werden kann. Ebenso kann das Bakterium häufig aus Lebensmitteln isoliert werden; etwa enthalten 50% aller getesteten Fleischproben enthielten lebensfähige Zellen. Dies ist insbesondere bedenklich, da viele Stämme von C. perfringens in der Lage sind Er­krankungen von Menschen und Tieren zu verursachen. lebensmittelbedingte Erkrankungen reichen von Enteritis nekroticans (Darmbrand) beim Menschen und verwandten Erkrankun­gen bei Tieren bis zu Lebensmittelvergiftungen durch die Bildung des sogenannten Cpe Ente­rotoxins. Die häufig und weltweit bei Zuchtgeflügel (aber auch nicht domestizierten Vögeln) auftretende nekrotische Enteritis führt zu beachtlichen ökonomischen Verlusten in der Geflü­gel-Industrie. Auch subklinische Infektionen mit C. perfringens führen zu erhöhtem Futter­konsum und geringerem Schlachtgewicht. Zur Kontrolle dieser Infektionen werden in der Geflügelzucht Antibiotika oft auch schon prophylaktisch (als "Wachstumsförderer") einge­setzt. Jedoch ist in der Europäischen Union (EU) die Benutzung der hier gebräuchlichsten Antibiotika wegen der möglichen Ausbildung von Kreuzresistenzen mit therapeutisch wichti­gen Antibiotika untersagt (EU-Richtlinie 70/524/EWG), zur Zeit wird strebt die EU sogar ein generelles Verbot an. Diese Situation macht die Entwicklung von neuartigen antimikrobiellen Wirkstoffen zur Kontrolle von C. perfringens zu einem aktuellen Thema.

Durch molekularbiologische Methoden ist es möglich geworden die speziellen Eigenschaften von bakteriellen Viren (Bakteriophagen) für den gezielten Nachweis und die Kontrolle dieser unerwünschten Bakterien in Lebensmitteln und der Umwelt zu nutzen. Wir interessieren uns unter anderem für die Enzyme und Proteine der Zellwand-lysierenden Systeme von Phagen für Listeria monocytogenes und Clostridium perfringens. Die Ergebnisse der Grundlagen-orientierten Arbeiten dienen als Basis für verschiedene methodische Weiterentwicklungen.

Funktionelle Analyse des Hol118 Holins: Regulation der Porenbildung durch einen N-terminal verkürzten Inhibitor

Functional analysis of the Hol118 holin: Regulation of pore formation by an N-terminally truncated inhibitor

Natasa Vukov, Siegfried Scherer, Martin Loessner

Für den zeitlichen Verlauf und die effektive intrazelluläre Lyse von phageninfizierten Bakte­rien ist außer den Endolysinen als Mureinhydrolasen meist noch ein zusätzliches Protein nö­tig, welches über Porenbildung in der Cytoplasma-Membran den Durchtritt der Endolysine an das Zellwand-Substrat ermöglicht. Diese kleinen hydrophoben Proteine werden aufgrund ih­rer Funktion als Holine bezeichnet. Die Primär-Sequenzen der Holinen sind sehr heterogen; es gibt fast keine signifikanten Homologien, außer bei einzelnen Phagen von taxonomisch sehr nah verwandten Bakterien. Wir haben ein Derivat des Phagen Lambda gt11 konstruiert, λ~Sthf, in dem das native Holin Gen S vollständig deletiert wurde und eine eingeführte Eco-RI - Schnittstelle das Einfügen eines heterologen Holin Gens erlaubt. Die Expression der Ly­sisgen-Kassette mit den klonierten Holin Genen kann mittels Prophagen-Induktion von λ~Sthf durch Inaktivierung des temperatursensitiven CIts857 Repressors erreicht werden. Beobachtung und Verlauf des zeitlichen Verlaufes der Lyse ermöglicht einen Vergleich der Funktion verschiedener Holine. Als erstes wurden die in der Funktion unterschiedliche Vari­anten des Lambda S Holins getestet. Die Expression des S105 Effektors führte zu sehr schneller, vorzeitiger Lyse, während der Inhibitor S107 deutlich schlechter lysierte. Dieses entspricht den Erwartungen und zeigt die Funktionalität des Systems. Die membranpermeabi­lisierende Aktivität des Hol118 Holins des Listeria monocytogenes Bakteriophagen A118 wurde ebenfalls getestet: Erstaunlicherweise lysiert λ~Sthf::hol118 in E. coli die Zellen rela­tiv spät, 90 min nach Induktion. Die Lyse konnte auch nicht durch eine Zerstörung des Membranpotentials vorzeitig induziert werden. Etwa 20 Minuten nach der λ~Sthf::hol118 Prophagen-Induktion war Hol118 in der inneren Membranfraktion von E. coli immunologisch nachweisbar. Entsprechend konnte das Hol118 Protein auch in der Membran von Listeria Zellen nach A118 Infektion nachgewiesen werden (Abb. 1).

Abb. 1: Nachweis von Hol118 in Membranen von Listeria Zellen nach Infektion mit A118. A: Ein-Stufen-Wachstums-Kurve von A118 mit Listeria monocytogenes 1001 als Wirt. B: Western Blotting zeigt das zwei verschiedene Spezies des Hol118 Proteins (Pfeile) in der bakteriellen Cytoplasma-Membran erscheinen; die untere Bande reprä­sentiert den Hol118(83) Inhibitor.

Um den potentiellen doppelten Start zu untersuchen, wurden Mutationen im N-Terminus ein­geführt und der Effekt dieser Mutationen getestet. Veränderungen des ersten und vierten ATGs hatten keinen bedeutenden Einfluss auf den zeitlichen Verlauf der Lyse. "Toeprinting" auf der hol118 mRNS zeigte ein zusätzliches ATG Start Kodon an Nukleotid-Position 40 in hol118. In vitro Versuche zeigten, dass diese Hol118(83) Variante von hol118 tatsächlich translatiert wird (Abb. 2).

Abb. 2: Toeprint Analyse und in-vitro Translation von hol118 und verschiedenen Mutanten Genen. A: 30S Translations-Initiierung durch Komplex Bildung auf hol118 mRNA. Die entstehenden Signale welche den normalen Start-Codons entsprechen sind mit Pfeilen markiert. Ein unspezifisches Signal ist mit einem Stern markiert. Die Ban­den auf der rechten Seite bilden die exakte Nukleotidsequenz ab. B: Nachweis der Polypeptid-Produkte von durch in-vitro Translation synthetisierten Hol118 Varian­ten. Spur 1, pSPhol118(wt); Spur 2, pSPhol118(96); Spur 3, pSPhol118(93); Spur 4, pSPHol118~M1Y13) (kodiert für Hol118(83)); Spur 5, pSPhol118M14I. Die untere Bande entspricht Hol118(83) (siehe Pfeil).

Das gekürzte Protein kann nur zwei Transmembrandomänen in der Membran bilden, ist nicht mehr funktionsfähig und kann das Endolysin R in λ~Sthf nicht mehr komplementieren. Diese funktionellen Eigenschaften von Hol118(83) zeigten eindeutig, dass die erste Transmembran­domäne für die porenbildende Funktion des Holins essentiell ist. Ersatz des M14 ATG Ko­dons in die für die Initiation der Translation in der Regel nicht verwendeten CTG oder ATT (M14L, M14I) führte zu zunehmend schnelleren Lyse (Abb. 3). Diese Ergebnisse zeigen eine Inhibitor-Funktion von Hol118(83), welches auch in trans Hol118 induzierte Lyse verhindern kann. Auf Grund dieser Ergebnisse wird ein neues Modell postuliert: Hol118(83), das an

Nukleotid-Position 40 des hol118 Gens startet, funktioniert als der Inhibitor der Lyse, und hat somit einen Einfluss auf die Regulation der Dauer der Latenzphase des A118 Bakteriophagen.

Abb. 3: Lyse-Profile von E. coli lysogenisiert mit λ~Sthf Varianten, welche hol118M14I, hol118M14L oder hol118M14V tragen. Verglichen mit dem Wildtyp-Allel, führt die Mutation von AUG-3 und die dadurch entstehenden M14 Substitutionen in den drei mutierten Holinen zur Eliminierung der Inhibitor Synthese. Dieses wiederum bedingt eine mehr oder weniger stark ausgeprägte Beschleunigung der Lyse.

Mit den Waffen des Feindes: Eine virale Murein-Hydrolase zur Zerstörung von Clostri­dium perfringens

With the weapons of the enemy: A viral murein hydrolase for destruction of Clostridium perfringens

Markus Zimmer, Siegfried Scherer, Martin J. Loessner

Bakterielle Viren sind die wohl am häufigsten vorkommenden selbstreplizierenden Einheiten auf diesem Planeten. Durch eine enzymatische Lyse der Wirtszelle am Ende des viralen Ver­mehrungszyklus wird die Nachkommenschaft freigesetzt. Diese Lyse wird in der Regel verur­sacht durch die Zusammenarbeit zweier phagenkodierter Proteine, dem Holin und dem En­dolysin. Das Holin ist ein niedermolekulares, hydrophobes Protein, welches sich in die Zellmembran eingelagert und nach Oligomerisierung durch die Ausbildung eines "Lochs" inner-halb der Membran dem Endolysin den Zugang zu seinem Substrat, dem Murein, gewährt. Endolysine sind Peptidoglykan-hydrolysierende Enzyme, deren Aktivität zur einer sehr schnellen und spezifischen Lyse der Wirtszelle führt. Sie haben zudem die Eigenschaft auch bei exogener Zugabe die Zellwand von Bakterien zerstören zu können. Kürzlich wurde be-richtet das Endolysine in in-situ Applikationen zur Kontrolle von naso-pharyngealen Strepto­coccus-Infektionen erfolgreich eingesetzt werden können. Auch konnte gezeigt werden, dass ein rekombinant in Lactococcus lactis produziertes und mittels eines Signalpeptids exportier­tes Listeria-Phagen-Endolysin in der Lage ist, Listeria monocytogenes Zellen im umgebenden Medium abzutöten. Unsere Arbeitsgruppe beschäftigt sich seit einiger Zeit mit den möglichen praktischen Anwendungen von phagenkodierten Endolysinen, welche sich möglicherweise als spezifische und wirksame antimikrobielle Alternative zu gängigen Antibiotika eignen. Ob dieses auch für Clostridium perfringens zutrifft, sollte nun geklärt werden.

Das zunächst durch Bioinformatik identifizierte duale Lyse-System kodiert für ein Holin und ein Endolysin. Die Analysen des Produktes von Gen 20 (als ply3626 bezeichnet) wiesen auf eine mögliche N-Acetylmuramoyl-L-Alanin Amidase Domäne im aminoterminalen Bereich des Polypeptides hin, welches sich auch in der lokalen Sequenzähnlichkeit von Ply3626 zu einer Reihe anderer Amidasen zeigt (Abb. 1). Diese lokal begrenzte Verwandtschaft weist außerdem auf eine modulare Domänenstruktur des Ply3626 Enzyms hin. Häufig besitzen die-se hochspezialisierten Enzyme eine enzymatisch aktive Domäne welche mit einer Zellwand-bindenden Domäne fusioniert ist, welche das Enzym in die Nähe des zu hydrolysierenden Substrates bringt, und die lytische Spezifität des Enzyms ganz entscheidend mitbedingt. Im Vergleich mit dem gesamten Enzym (siehe nächster Abschnitt) zeigte ein C-terminal ver­kürztes Ply3626 Endolysin (mit vollständiger N-terminaler Amidase Domäne) keinerlei lyti­sche Aktivität. Dieses spricht dafür dass hier nicht nur der N-Terminus sondern auch der C-Terminus eine essentielle Rolle für die lytische Aktivität des Enzyms besitzt.

Das Endolysin-kodierende Gen ply3626 wurde zunächst in einen gängigen Stamm von E-scherichia coli kloniert und exprimiert. Es war jedoch keine Enzymaktivität nachweisbar, und weitere Untersuchungen haben gezeigt dass die Zellen nicht in der Lage waren das Ply3626 Protein zu synthetisieren. Als Ursache dafür konnte der sehr verschiedenen G+C Gehalte der involvierten Organismen (E. coli 50.8 % bzw. C. perfringens 28.6 %) und der damit verbun­denen unterschiedlichen Benutzung von Codons ausgemacht werden. Nachdem der zur hete­rologen Produktion ausgewählte Stamm mit zusätzlichen Kopien von in E. coli selten vor-kommenden Gene für tRNAArg und tRNAIle ausgestattet wurde, war die Proteinsynthese möglich. Die hierbei nach Induktion zunächst beobachtete Bildung von unlöslichen Ein­schlusskörpern konnte durch eine starke Absenkung der Expressionsrate (Temperatur, Transkriptionsrate) vermieden werden. Die in der cytoplasmatischen Fraktion vorliegenden rekombinanten Endolysine zeigten spezifische lytische Aktivität gegenüber Clostridium perfringens Zellen (siehe unten). Eine aminoterminale Veränderung des Enzyms durch das Hinzufügen eines Hexa-Histidin Polypeptides (HPL3626) hatte keinen negativen Effekt auf die enzymatische Aktivität und erlaubte eine einfache und schnelle Aufreinigung der aktiven Enzyme mittels Nickel-Chelat Affinitätschromatographie.

Lebende Zellen von 48 getesteten C. perfringens Stämme waren sensitiv gegenüber der Ply3626 Murein Hydrolase (Abb. 2), und wurden innerhalb kurzer Zeit lysiert. Im Gegensatz dazu waren andere Clostridium-Arten generell nicht empfindlich, und auch andere Bakterien (insgesamt 34 Stämme) wurden von den Enzymen nicht lysiert. Diese hohe Spezifität von Ply3626 gegenüber C. perfringens ist von hohem Wert für nun mögliche Anwendungen, zum Beispiel die Entwicklung neuer biologischer Maßnahmen zur Kontrolle der Entwicklung von C. perfringens in Lebensmitteln, Futtermitteln oder auch komplexen mikrobiellen Lebensge­meinschaften. Diese äußerst spezifische lytische Wirkung scheint ein übergeordnetes Merk-mal von phagenkodierten Endolysinen zu sein. In anderen Untersuchungen konnten wir be­reits Genus- oder manchmal auch Spezies-spezifische Lyse durch rekombinante Endolysine von Bakteriophagen für Listeria monocytogenes, Bacillus cereus oder Staphylococcus aureus beobachten. Dieses Spektrum unterschiedlicher Zielorganismen soll durch weitere Untersu­chungen noch ausgebaut werden.

Abb. 1: Der Vergleich der Aminosäure-Sequenzen zeigt die Ähnlichkeiten im aminotermi­nalen Bereich von Ply3626 zu anderen lytischen Amidasen. Der dunkel eingefärbte Bereich markiert die wahrscheinliche N-Acetylmuramyl-L-Alanin Amidase Domä­ne. Die Größe der Proteine (in Aminosäuren) wird durch den Maßstab angedeutet.

Abb. 2: Zusammenfassung der Lyse-Assays von Clostridium Zellsuspensionen mit rekombi­nantem Ply3626. Die prozentuale Abnahme der optischen Dichte (OD600, Y-Achse) wird nach der Zugabe des Enzyms zu C. perfringens Zellen über die Zeit (X-Achse) verfolgt. Die untere Kurve (Dreiecke) visualisiert die Lyse von C. perfringens NCTC 3110 Zellen, dem Wirtsstamm von φ3626. Die Negativkontrolle (Extrakt von E. coli ohne Enzym) ist oben angedeutet (Kreise). Die "durchschnittliche" Lyse von 48 unterschiedlichen C. perfringens Stämmen wird durch die schwarze Linie repräsentiert und die Standardabweichung durch den grau schattierten Bereich.

Arbeitsgruppe:

Identifizierung lebensmittelrelevanter Mikroorganismen Gruppenleiter: Herbert Seiler

Validierung der Gesamtkeimzahlbestimmung von Milch mit dem MicroFoss-System Determination of total viable counts in dairy products with the MicroFoss Analyzer

Angelika Michl, Michael Kümmerle, Herbert Seiler

Der MicroFoss-Analyzer (MFA) ist ein relativ neues Gerät zur Schnellbestimmung von Keimzahlen. In einem Röhrchen befindet sich ein spezifisches Voll- oder Selektiv-Flüssigmedium. Hierin wird die flüssige Probe direkt oder nach Verdünnung mit Pufferlösung überführt; stückige Proben werden zuvor homogenisiert. Am Boden des Röhrchens befindet sich ein Agarpfropfen mit Redox- und pH-Indikatoren. Mikrobielle Stoffwechselprodukte diffundieren in den Agar und verändern die optische Dichte. Diese wird alle sechs Minuten gemessen. Geringste, signifikante Differenzen gegenüber dem Ausgangswert werden über eine Bebrütungszeit-abhängige Kalibrationskurve in Keimzahlen der Ausgangsprobe umge­rechnet. Je schneller die Kurve ansteigt (bei ~10⁶ Keimen/ml), umso höher war die Aus­gangskeimzahl. Nach Vorgabe sollte die Bestimmung der Gesamtkeimzahl (Gkz) höchstens 20 h dauern. Unter Berücksichtigung der Arbeitsroutine hätte man also am Tag nach dem An-setzen der Probe das Ergebnis vorliegen, bei sehr hoher Ausgangskeimzahl schon am gleichen Tag.

Wir überprüften das Gerät hinsichtlich der Erfassung von Gkz'en. Die Proben stammten aus der Routine einer Molkerei. Es wurden die Produkte Rohmilch (RM) und pasteurisierte Milch (PM) untersucht. Im Vergleich wurden die Keimzahlen nach dem Koch`schen Plattenverfah­ren mit PCA bestimmt. Es standen auch die Daten des Milchprüfrings zur Verfügung (Bac­toscan-Methode). Für die Kalibrierungskurven wurden Proben bebrütet und dann mit UHT-Milch verdünnt. Die Kalibrierung der Gkz von RM zeigte einen guten Korrelationskoeffi­zienten von -0,91. In einer ersten Versuchsphase ergaben sich für die Gkz-Bestimmungen von Milch aus Tanksammelwagen sehr gute Übereinstimmungen zwischen den Methoden. Selten betrugen die Abweichungen mehr als eine log-Einheit. Später aber wurden mit dem MFA die Rohmilchkeimzahlen scheinbar immer höher und erreichten innerhalb von zwei Wochen eine unakzeptable Abweichung gegenüber den Kontrollen. Offenbar hatte sich die Populations­struktur in der RM so stark verändert, dass die Kalibrierung nicht mehr zutreffend war. Es wäre also eine neue Kalibrierung erforderlich gewesen. Demnach wird die Reaktionsge­schwindigkeit im MFA von der Keimzahl und der Populationsstruktur bestimmt. Nachdem letztere aber eine "black box" für die Routineanalyse im Molkereilabor ist und unvorherseh­baren Schwankungen unterliegt, kann diese Methode bei gleicher Gkz keine stabilen Werte liefern.

Die Kalibrierung von PM-Proben mit 113 Werten ergab den Korrelationskoeffizienten -0,94. Diese Daten waren auch für thermisierte Milch und Erhitzerproben passend. Aber auch hier blieb die Flora offenbar nicht stabil, da nach einer anfänglichen Phase guter Korrelation zwi­schen den Methoden später mit dem MFA deutliche Fehlbestimmungen in Serie zu verzeich­nen waren. Im Übrigen ergaben sich auch immer wieder unerklärbare deutliche Ausreißer mit der MFA-Methode. Diese waren nicht immer reproduzierbar, waren aber nachweislich nicht personenbezogen.

Es ist plausibel, dass bei gleicher Keimzahl eine Bacillus cereus- bzw. B. subtilis-dominierte Flora sich im MFA jeweils unterschiedlich einer Korrelationskurve zuordnet. Noch gravie­render sind wohl die Abweichungen, wenn die Flora der Probe von einer Bazillen-Dominanz zu einer Milchsäurebakterien-, Enterobakterien- oder Pseudomonaden-Dominanz wechselt. Demnach ist der MFA eher ein System für die Bestimmung der voraussichtlichen Haltbarkeit der Milch. Die Änderung der optischen Dichte ist ein Summenparameter für mikrobielle Stoffwechselaktivitäten. Offenbar eignet sich das System weniger für eine dauerhaft gute Be­stimmung der Gkz. Unsere Erwartung, dass in Milch eine generell annähernd gleiche Popula­tionszusammensetzung vorläge und damit der Einfluss von Floraverschiebungen auf das Test-system sich innerhalb eines tolerierbaren Bereichs bewegen würde, wurde nicht bestätigt.

Nachweis von Coliformen und Escherichia coli in Milch mit dem MicroFoss-System

Determination of coliform counts and E. coli counts in dairy products with the MicroFoss Analyzer

Angelika Michl, Michael Kümmerle, Herbert Seiler

Wir überprüften das Gerät hinsichtlich der Erfassung von Coliformen- (Cf) und Escherichia coli (EC)-Keimzahlen im Routinebetrieb einer Molkerei. Es wurden die Produkte Rohmilch, Pasteurisierte Milch, Thermisierte Milch und Butter untersucht. Im Vergleich wurden die Keimzahlbestimmungen nach dem konventionellen Koch`schen Plattenverfahren mit Chro­mocult-Agar und VRB-Agar durchgeführt. Bestätigungsidentifizierungen erfolgten mit Ente­rotube, API-20/50E, FTIR-Spektroskopie, 16s-rDNA-Sequenzierung u.a. Der Test auf Cf bzw. EC wurde in den Versuchen entgegen den Herstellerempfehlungen von 9 - 10 h auf 18 bzw. 15 h verlängert.

Eine Übereinstimmung zwischen MFA und Agarplattentest war gegeben. Vereinzelt signali­sierte die MFA-Methode gegen Ende unserer Bebrütungszeit ein falsch positives Ergebnis. Dies lässt sich aber vermeiden, wenn man entsprechend den Herstellerempfehlungen den An­satz nach 9-10 h abbricht. Hierbei schlagen dann beim Nachweis auf Cf keine nicht-Cf Ente­robacteriaceae und beim Nachweis auf EC keine Cf durch. Auf den Platten wurden vereinzelt falsch positive Ergebnisse notiert. Die Identifizierung der Kolonien ergab, dass es sich nicht um EC oder Cf, sondern um andere Enterobacteriaceae, Pseudomonaden und Acinetobakte­rien handelte; deren Kolonien können gelegentlich mit Cf oder EC verwechselt werden. Dem-nach ist die Plattenmethode weniger selektiv als die MFA-Methode. Insgesamt wurden aber zu wenige positive Proben untersucht, als dass man über die Güte der quantitativen Analyse bereits eine abschließende Aussage treffen könnte.

Die meisten Molkereiprodukte sollten generell frei von EC und Cf sein. Folglich ist eigentlich nur ein Ja/Nein-Ergebnis gefragt. Dies lässt sich mit konventionellen Methoden (z.B. BGL-Bouillon) relativ einfach erzielen. Somit ist es überlegenswert, ob sich trotz der guten Ergeb­nisse mit dem MFA die Investitionskosten lohnen. Wir sehen vor allem ein Potenzial für die Qualitätskontrolle von Rohmilcherzeugnissen, also bei Proben, bei denen die Kenntnis der absoluten Keimzahlen dieser Organismen wichtig ist.

Populationsstruktur von Enterobacteriaceae in Milch und Milchprodukten

Diversity of Enterobacteriaceae in dairy products

Angelika Michl, Michael Kümmerle, Herbert Seiler

Im Rahmen der Untersuchung über den MicroFoss-Analyzer wurden Enterobacteriaceae aus Rohmilch (RM), pasteurisierter Milch (PM), thermisierter Milch (TM) und Butter isoliert und identifiziert. Von 269 Proben RM waren 5 positiv; 19 Stämme wurden isoliert und identifi­ziert. Die entsprechenden Zahlen für PM, TM und Butter betrugen 405/10/15, 57/18/26 und 328/137/229. Hiervon wurden 263 Isolate identifiziert: 24 von RM, 15 von PM, 26 von TM und 198 von Butter. Am häufigsten wurde Klebsiella oxytoca mit 58 Isolaten nachgewiesen, gefolgt von Escherichia coli (75), Enterobacter cloacae (49), Citrobacter freundii (30), Ente­robacter intermedius (18), Klebsiella planticola (9), Kluyvera ascorbata (6), Enterobacter amnigenus (5), Serratia liquefaciens (4), Klebsiella terrigena (2) sowie Buttiauxella izardii, Erwinia rhaganti, Klebsiella pneumoniae, Obesumbacterium proteus, Pantoea stewartii, Proteus mirabilis und Yersinia enterocolitica (je 1).

Bei einigen Isolaten ergab sich ein vager Verdacht auf Salmonellen. Die Tests mit SIM, FTIR-Spektroskopie, Salmonella-Ident-Agar und Antikörper-Agglutination sprachen dafür. Andererseits waren die Kolonien auf XLD und BPLS nicht typisch; auch die 16s-rDNA­Sequenzierung ergab ein eher negatives Resultat. Zur Absicherung wurden Stämme an das RKI in Berlin zur Identifizierung geschickt. Von dort wurde zweifelsfreie Entwarnung gege­ben. Es handelte sich um Enterobacter spp. und Klebsiella spp. Demnach war es zu einer un­spezifischen Agglutination mit dem polyvalenten Salmonella-Antiserum gekommen. Dies belegt die Bedeutung einer Bestätigungsreaktion für solche Fälle, damit nicht unnötiger wirt­schaftlicher Schaden entsteht. Das Risiko einer Isolierung von im Salmonella-Agglutinations­test falsch positiven Enterobakterien ist dann weniger gegeben, wenn die Kolonien aus einer Salmonella-selektiven Anreicherung isoliert wurden. Bei der Untersuchung von Milch und Milchprodukten auf Salmonellen ist demnach dieser Primärschritt unerlässlich.

Schnelle Analyse von Käsereifungskulturen mit FTIR-Mikrospektroskopie

Fast analysis of cheese ripening floras by FT-IR microspectroscopy

Vera Theilmann, Mareike Wenning, Siegfried Scherer

Die Oberflächenreifungsflora von Rotschmierekäse ist sehr komplex und besteht zum über-wiegenden Teil aus coryneformen Bakterien. In der Regel ist die genaue Zusammensetzung der Flora jedoch nicht bekannt, da neben eingesetzten Reifungsorganismen auch die individu­elle Hausflora des produzierenden Betriebes einen wesentlichen Einfluss auf die Käsequalität haben kann. Eine Flora, deren Zusammensetzung nicht bekannt ist, lässt sich jedoch nicht standardisieren und auch nicht kontrollieren, so dass dem Betrieb ein wichtiges Mittel zur Sicherung gleichbleibender Produktqualität fehlt. Eine Methode zur einfachen Analyse ge­mischter Reifungsfloren auch hinsichtlich ihrer quantitativen Zusammensetzung könnte einen wichtigen Beitrag zur Qualitätssicherung leisten. FTIR-Mikrospektroskopie kann hier das geeignete Verfahren sein, da Mikroorganismen ohne vorherige Isolation aus einer Probe über Infrarotspektren identifiziert werden können.

Die Probe wird in geeigneter Verdünnung auf einem festen Medium unter standardisierten Bedingungen inkubiert und die enthaltenen Mikroorganismen wachsen zu Mikrokolonien heran, die dann über eine Abstempelvorrichtung von der Agarplatte auf ein IR-transparentes Trägermaterial überführt werden. Das IR-Mikroskop kann auch als Lichtmikroskop verwen­det werden und ist an das Spektrometer und einen Computer angeschlossen. Die ca. 100 µm großen, auf das Trägermaterial überführten Kolonien werden detektiert und markiert und an-schließend automatisiert gemessen. Über einen Vergleich mit Referenzspektren einer vorher erstellten Datenbank können die gemessenen Kolonien identifiziert werden.

Die Erstellung der Datenbank mit Referenzspektren für coryneforme Bakterien impliziert die Erarbeitung eines standardisierten Protokolls für die Anzucht der Mikroorganismen. Der wichtigste Faktor für die Erzielung guter Spektren ist der Zeitpunkt des Transfers der Kolo­nien von der Agarplatte auf das Trägermaterial, da hierdurch die Größe der Kolonien determi­niert wird. Aufgrund sehr unterschiedlicher Wachstumsgeschwindigkeiten der verschiedenen

Spezies wurden drei Stempelzeitpunkte bei 20, 30 und 48 h festgelegt. Für den Aufbau der Datenbank wurden 54 Stämme aus 17 Spezies gewählt; 43 Stämme wurden mit einem Spekt- rum abgelegt, da sie eindeutig einem Stempelzeitpunkt zugeordnet werden konnten, 11 Stämme dagegen wurden mit zwei Spektren für zwei verschiedene Stempelzeitpunkte in der Daten- bank hinterlegt.

Die Anwendbarkeit der Methode wurde anschließend in einer Analyse der Oberflächenflora eines schmieregereiften Schnittkäses geprüft. Als Referenzmethode für die Identifizierung diente die bereits sehr gut etablierte FTIR-Spektroskopie mit Keimsuspensionen. Innerhalb von 4 Tagen wurden insgesamt 1000 Spektren von Mikrokolonien, verteilt auf drei Stempel- zeitpunkte nach 20, 30 und 48 h, aufgenommen und mit der Referenzdatenbank identifiziert. Über den computergesteuerten Objekttisch des Mikroskops können die Kolonien nach der Messung wieder exakt angesteuert, mit einem Zahnstocher vom Stempel auf eine Agarplatte überführt und nach anschließender Bebrütung mit alternativen Methoden, in diesem Fall FTIR-Spektroskopie mit Keimsuspensionen, identifiziert werden. In unserer Analyse wurden stichprobenartig ca. 130 Kolonien vom Stempel gepickt und die Identifizierungen der Mikro- spektroskopie zum großen Teil bestätigt. Abb. 1 zeigt das Dendrogramm der Messungen nach 48 Stunden. Die Flora des untersuchten Käses setzt sich demnach aus mindestens vier ver- schiedenen Organismen zusammen; Staphylococcus equorum, Brevibacterium linens, Cory- nebacterium ammoniagenes/casei (diese beiden Spezies sind phänotypisch sehr ähnlich und darum kaum zu unterscheiden) bzw. Corynebacterium glutamicum und einer Spezies, die bis- her noch nicht identifiziert werden konnte.

Abb. 1: Dendrogramm der Messungen des Stempelzeitpunktes 48 h mit Zuordnung der Iden­tifizierungen.

Innerhalb einer Woche ist es uns gelungen, mit einer großen Stichprobe von 1000 Mikrokolo­nien die komplette aerobe Flora eines Schnittkäses quantitativ zu analysieren. Zudem konnten die Identifizierungen der Mikrospektroskopie durch FTIR-Spektroskopie mit Ausnahme der noch nicht in der Datenbank vertretenen Organismen bestätigt werden. Die Benennung der

noch nicht identifizierten Spezies und der nicht eindeutig identifizierten Organismen soll mit 16S rDNA-Sequenzierungen geklärt werden.

Arbeitsgruppe:

Mikrobiologie von oberflächengereiften Käsen

Gruppenleiter: Siegfried Scherer

Die Zusammensetzung der Reifungsflora von Rotschmiereweichkäsen aus Deutschland (Lim-burger, Romadur) oder Frankreich (z.B. Münster, Epoisses) ist außerordentlich komplex.

Für die Produktion von Rotschmierekäsen ist die Entwicklung einer fehlerfreien, geschlosse­nen Schmiereoberfläche unerlässlich. Um Käse mit einem hohen Qualitätsstandard zu produ­zieren, wird bei der Herstellung in kleineren und auch größeren Betrieben die traditionelle Methode des „Alt-Jung-Schmierens“ verwendet. Mit dem Schmierevorgang wird dabei er-wünschte mikrobielle Flora von bereits gereiften auf die „jungen“ Käse übertragen.

Jedoch können dabei auch unerwünschte, pathogene Mikroorganismen wie z.B. Listeria mo­nocytogenes immer wieder auf die neuen Produktionschargen übertragen werden und sich zu hohen Keimzahlen auf der Oberfläche entwickeln. Eine rasche Entwicklung der Oberflächen-flora verhindert das Wachstum von diesen unerwünschten und/oder pathogenen Mikroorga­nismen und trägt daher entscheidend zur Qualitäts-, wie auch Produktsicherung bei. Aller-dings weisen die Schmierekulturen, wenn sie aus der Flüssigkultur auf den jungen Käse über-tragen werden häufig eine verzögerte Anwachsrate auf. Die Bakterien sind am Käse starken abiotischen Stressoren (niederer pH, hohe Salzkonzentration, tiefe Temperaturen) ausgesetzt und eine gezielte Streß–Antwort auf diese Umweltbedingungen ist für die schnelle Entwick­lung einer geschlossenen Schmiereoberfläche unerlässlich. Dass Rotschmiere-bakterien die Fähigkeit haben am Käse zu überleben impliziert, dass spezielle Mechanismen in den Bakte­rien existieren, sich an die geänderten Umweltbedingungen anzupassen. Die molekularbiolo­gischen Faktoren der Stressantwort von Coryneformen Bakterien sind bisher unbekannt. Das Ziel dieses Projekts ist, auf molekularer wir auch proteinanalytischer Ebene, ein besseres Ver­ständnis für das Verhalten von Rotschmierebakterien auf der Käseoberfläche zu erwerben um in Zukunft Schmierekulturen zu erzeugen, die gegenüber Stressoren toleranter und daher für den Einsatz in der Rotschmierekäseproduktion geeigneter sind.

Adaptation von Reifungskulturen an sauren pH

Acid adaptation of cheese ripening strains

Kinga Kiss. Barbara Silakowski, Siegfried Scherer

Käsereifung ist ein komplexer Prozess, der vor allem Glykolyse, Fettspaltung und Proteolyse umfasst. Während des Reifungsprozesses werden Hefen (Debaryomyces hansenii) und Bakte­rien (Coryneforme, Staphylokokken) von bereits gereiften auf die grünen Käse übertragen. Diese Mikroorganismen sind u. a. für das charakteristische Aroma eines Käses verantwort­lich. Da die Reifung ein langwieriger und aufwendiger Prozess ist, zeigt die Käseindustrie großes Interesse an der Verkürzung dieser Zeit.

Während des Reifungsprozesses spielt der Säure-Abbau eine Hauptrolle. Am Anfang des Reife-stadiums liegt der pH des Käses im sauren Bereich (pH 5.5), so dass nur die säure-toleranten Hefen in der Lage sind, darauf zu wachsen. Das Wachstum der Bakterien beginnt dann erst, wenn der pH des Käses alkalischer wird. Daraus kann man folgern, dass der Reifungsprozess beschleunigt werden kann, wenn die Bakterien adaptiert wären, bei pH 5.5 zu wachsen.

Abb 1: Wachstumskurven von S. equorum und den pH-adaptierten Mutanten

Von den Oberflächen-Reifungskulturen, Corynebacterium variabile, C. ammoniagenes, Staphylococcus equorum und Kocuria palustris, wurden mit Hilfe von pH-Gradienten-Agarplatten Kolonien isoliert, die bei pH 6 bzw. pH 5.5 wachsen. Die Wachstums­eigenschaften der so erhaltenen pH-Mutanten wurden bei 15°C und 30°C mit einem honey­comb well reader, Bioscreen C überprüft. Die Stabilität der Mutanten wurde so überprüft, in dem sie für 24 Stunden bei pH 7,2 bebrütet wurden, und dann wieder bei dem pH weiter in­kubiert wurden, auf den sie adaptiert wurden. Die pH-Mutanten der vier Stämme wuchsen bei 30 °C und niedrigem pH wesentlich besser als die entsprechenden Wildtyp-Stämme. Die pH­Mutanten von C. variabile und S. equorum wachsen bei 15°C wesentlich besser als der Wildtyp. Jedoch verlieren diese beiden Mutanten ihre vorteilhaften Veränderungen, nach einer 24-stündigen Bebrütung bei neutralem pH. Die Wachstumsraten der pH-Mutanten von C. ammoniagenes und K. palustris waren gleich bzw. schlechter als die der jeweiligen Wildtypen bei 15°C. Jedoch sind diese Mutanten in der Lage die erworbenen vorteilhaften Veränderun­gen nach einer 24-stündigen Bebrütung bei pH 7,2 beizubehalten.

Temporal stability and biodiversity of two complex, anti-listerial cheese ripening micro­bial consortia.

Ariel Maoz, Ralf Mayr and Siegfried Scherer

The development of the microbial consortia during the ripening of red smear cheeses is achieved by transferring ripening cultures onto the surface of younger ones according to the old young smearing method. In the present study temporal stability, and diversity of, bacterial species composition as well as anti-listerial potential of two different, complex and undefined microbial consortia (R and K) from red smear soft cheeses was investigated.