|
|
|
|
|
|
Scientific Publications - Work Done by Microbiology Reader
Masaryk University, Faculty of Science, Department of Microbiology, Brno, Czech Republic, Report, 65 pp. [Růst a množení bakteriálních buněk]Horakova Dana, Nemec Miroslav
Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Katedra mikrobiologie Laboratorní cvičení z fyziologie bakterií Řešitelé: Horáková Dana, Němec Miroslav Technická spolupráce: Szostková Monika Podporováno
Fondem rozvoje
1 Růst a množení bakteriálních buněk
Úvod Množení bakterií sledujeme zpravidla podle počtu bakteriálních buněk, který lze stanovit přímo, pomocí upravené počítací komůrky nebo nepřímo nefelometricky, výsevem na agarové plotny s následným počítáním vyrostlých kolonií nebo užitím vhodných fyziologických metod. Různé typy metod stanovení počtu bakteriálních buněk mají svoje přednosti, ale na druhé straně i nevýhody. Výhodou nefelometrického stanovení, zejména s využitím automatických systémů, je relativně rychlé a technicky málo náročné vyhodnocení, poskytující získání poměrně přesných hodnot. Na druhé straně je však tato metoda zatížena chybou vyplývající ze skutečnosti, že na zákalu buněčné suspenze se podílejí i mrtvé buňky. Tento nedostatek může být do značné míry odstraněn stanovením počtu životaschopných bakterií plotnovou metodou. Nevýhodou plotnové metody stanovení počtu buněk je však její časová a materiálová náročnost.
1.1 Plotnová metoda Princip metody Životaschopné mikrobiální buňky na vhodných ztužených kultivačních médiích vytvářejí kolonie, které jsou tvořeny potomstvem jedné mikrobiální buňky. Výsevem buněk na živné médium v daných časových intervalech lze posouditzměnu v počtu buněk v tekutém médiu v průběhu kultivace.
Materiál a zařízení · Mikroorganizmy : Salmonella typhimurium LB 5000 · Chemikálie a roztoky: tekuté LB-médium , LB-agar · Přístroje: vodní lázeň s třepačkou, termostat
Postup Celý pracovní postup provádíme přísně sterilně ve flow-boxu. Do 10 ml LB-média naočkujeme kličku bakteriální kultury uchovávané na šikmém LB-agaru. Kultivujeme staticky 12 hodin při 37 °C. 2 ml narostlého inokula očkujeme do 100 ml LB-média (výsledná koncentrace buněk cca 5.107 CFU /ml) a kultivujeme ve vodní lázni při 37 °C (150 kyvů/min., amplituda 7). Odběry vzorků provádíme v časových intervalech 0; 30; 60; 90; 120; 150; 180; 210; 240; 270; 300 minut. Sterilně odebraný vzorek (cca 2 ml) ředíme v tekutém LB-mediu. Pro časové intervaly 0-150 minut doporučujeme ředění 10-4, 10-5 a 10-6, pro ostatní časové intervaly ředění 10-5, 10-6, 10-7. Z jednotlivých ředění vyséváme po 0,1 ml na Petriho misky s LB-agarem a rozetřeme po povrchu agaru sterilní hokejkou. Pro každé ředění volíme nejméně dvě opakování. Naočkované misky kultivujeme v termostatu při 37°C obrácené dnem vzhůru. Po 24 hodinách kultivace odečteme vytvořené kolonie a provedeme hodnocení růstu. 4 Vyhodnocení a závěr Stanovení počtu buněk v bakteriální kultuře Průměrný počet buněk ve vzorku odebraném v čase t: CFU/ml = počet kolonií na misce × 1/použité ředění × 10
Sestrojení růstové křivky Grafická závislost log CFU/ml na době kultivace buněk (t = 0-300 min.)
Růstové parametry Výpočet doby lagu (L), průměrné konstanty rychlosti růstu (k), průměrné generační doby (g), specifické růstové rychlosti (µ) 1.2 Bioscreen C - stanovení pH optima pro růst buněk Princip metody Plně automatické zařízení Bioscreen C umožňuje provádět velké množství testů v několika dnech či týdnech. V jednom pokusu lze sledovat růst buněk až ve 200 vzorcích (na dvou inkubačních destičkách). Testy je možné provést 10 až 20-krát rychleji než s použitím běžných manuálních technik. Zařízení je schopno měřit pomocí speciálních filtrů zákal mikrobiální kultury v tekutém růstovém médiu. Inkubační teplotu lze nastavit od 1 do 60°C. Systém Bioscreen C se skládá z inkubační a měřící jednotky (Obr. 1) a z počítače, ve kterém je instalován odpovídající software sloužící k zaznamenávání růstových křivek a jejich vyhodnocení. Inkubace, míchání a kinetická měření probíhají automaticky podle nastavených parametrů daného pokusu. Zařízení Bioscreen C lze využít pro běžné sledování růstu buněk, sledování vlivu antibiotik, farmak nebo růstových inhibitorů na množící se buňky, stanovení MIC, vývoj nových růstových medií, vlivu pH na růst buněk, sledování průběhu lyze buněk apod. Materiál a zařízení · Mikroorganizmy: Pseudomonas pictorum CCM 284 · Chemikálie a roztoky: masopeptonový bujon č.1 (MPB1)o různé hodnotě pH; masopeptonový agar č. 1 ( MPA1) · Přístroje : Bioscreen C (software BioLink v DOS, export dat do MS EXCEL) http://www.transgalactic.com/microbiology/bioscreen_c.htm Postup Celý pracovní postup provádíme přísně sterilně ve flow-boxu. Inokulum získáme naočkováním 20 ml MPB 1 přibližně 108 CFU/ml Pseudomonas pictorum ze šikmého agaru (MPA 1). Buňky inkubujeme 24 h v termoboxu za intenzivního třepání (128 kyvů/min.) při teplotě 26 °C. Sterilní inkubační destička přístroje obsahuje 100 jamek (Obr. 2). Do 5 jamek sterilně pipetujeme 330 µl MPB 1 o odpovídající hodnotě pH (použijeme automatickou pipetu). Např. jamky 1 až 5 plníme bujonem o hodnotě pH 5,5; jamky 6 až 10 - pH 6,5; jamky 11 až 15 - pH 7,0; jamky 16 až 20 - pH 7,5. Do všech jamek přidáme 10 µl čerstvého inokula. Kultivaci provádíme při teplotě 26 °C po dobu 48 hodin. Měření zákalu při vlnové délce λ =600 nm probíhá každé 2 hodiny podle nastavení parametrů na Bioscreen C. 5
Obr. 1 Zařízení Bioscreen C
Nastavení parametrů přístroje (provádíme podle návodu za přítomnosti obsluhujícího personálu): Otevřeme program v systému MS DOS. Nastavíme nový program podle návodu.Vyplníme kolonku pro bližší popis testu. Po zobrazení destičky zvolíme šipkami a mezerníkem „Simple editor“ a „Grafical well map“. Zadáme konečný objem v jamce, zadáme jednotky, ve kterých bude provedeno měření, zvolíme počet opakování pro daný vzorek a popis vzorku. Zvolíme počet vzorků. Zadáme parametry měření (pomocí všech 4 šipek a potvrzujeme Enter).Stisknutím tlačítek Ctrl + Enter odsouhlasíme parametry, kurzor umístíme na Measurement a zahájíme měření stisknutím tlačítka Enter. 6
Obr. 2 Inkubační destičky
Vyhodnocení a závěr Po zpracování výsledků softwarem Bioscreen C vytisknout hodnoty OD600 do tabulky. Vypočítat průměrné hodnoty zákalu z 5 opakování a sestrojit růstovou křivku. Z průměrných hodnot střední generační doby pro kultivační média o různé hodnotě pH (výpočet bude proveden automaticky softwarem po převedení do MS Excel ) sestrojit graf závislosti průměrné generační doby na zvolené hodnotě pH kultivačního média.
Literatura http://www.transgalactic.com/microbiology/bioscreen_c.htm 7 2 Bakteriální biomasa
2.1 Stanovení bílkovin metodou podle Bradfordové Úvod Při některých pokusech, zaměřených zejména na studium enzymatické aktivity buněk, je nutné vztahovat naměřené hodnoty na konstantní jednotku biomasy. Tímto přepočtem obdržíme hodnoty, které lze mezi sebou srovnávat, třebaže jsou experimenty prováděny v různých časových odstupech nebo na různých mikroorganizmech. V běžné laboratorní praxi je enzymatická aktivita nejčastěji vztahována na sušinu, bílkovinu, dusík apod. Pro stanovení koncentrace bílkovin může být využita celá řada metod, lišících se rozsahem stanovení a dobou nutnou k jejich provedení. Mezi nejznámější používané metody stanovení bílkovin v biologickém materiálu patří např. Biuretová metoda, Folinova metoda, Lowryho metoda, metoda dle Bradfordové, fluorescence, polarografie a další. Mezi velmi přesné metody stanovení bílkovin patří metoda dle Bradfordové, která je standardizovaná v programu spektrofotometru Spectronic GenesysTM 5. Princip metody Při vazbě Coomassie Brilliant Blue G250 na bílkovinu dochází k posunu absopčního maxima z 464 nm na 595 nm. Vzrůst absorbance při 595 nm může být použit jako měřítko koncentrace bílkovin. K posunu absorpčního maxima dochází velmi rychle (2-5 min) a vybarvení je stabilní nejméně jednu hodinu. Metoda je vhodná pro všechny proteiny, ačkoliv počet vazeb s barvivem může být proměnlivý v závislosti na obsahu basických aminokyselin v bílkovině. Je proto důležité, aby standardní roztok bílkoviny měl obdobné složení jako testovaný vzorek. Hodnoty absorbance může zvyšovat přítomnost detergentů ve vzorku. Pro každé stanovení je nutné sestrojení kalibrační přímky.
Materiál a zařízení · Mikroorganizmy: Micrococcus luteus, Pseudomonas putida, Escherichia coli, Bacillus cereus, Bacillus subtilis (ze sbírky ústavu) · Chemikálie a roztoky: MPB1; pufr fosfátový (0,05M;pH = 7,2);zásobní roztok lidského albuminu (0,1 g v 10 ml fosfátového pufru); činidlo Coomassie Brilliant Blue G250 · Přístroje: chlazená centrifuga; fotometr Spekol 11; spektrofotometr Spectronic GenesysTM5 8 Postup Příprava vzorku.100 ml MPB 1 v promývací láhvi naočkujeme 1 kličkou zásobní kultury ze šikmého agaru. Kultivujeme 24 h při 30°C za intenzivní aerace. Takto připravené kultury různých mikroorganizmů centrifugujeme v chlazené centrifuze při 6000 ot.min-1 (teplota +4°C) po dobu 20 min. Supernatant opatrně slijeme, buněčný sediment resuspendujeme ve fosfátovém pufru a znovu centrifugujeme v chlazené centrifuze. Tento proces opakujeme nejméně dvakrát (tzv. promývání buněk), abychom z povrchu buněk odstranili balastní organické látky. Bakteriální sediment ředíme fosfátovým pufrem tak, aby zákal suspenze při ~ = 600 nm odpovídal cca 80%. Přesnou hodnotu zákalu suspenze zaznamenáme. Sušinu bakteriální suspenze stanovíme podle postupu v kapitole 2.2. Příprava standardů. Ředěním zásobního roztoku lidského albuminu (0,1 g /ml)destilovanou vodou připravíme 5 standardních koncentrací pro sestrojení standardní přímky : 200; 400; 600; 800; 1000 ~g albuminu /ml . Měření (program Bradford-standard, Genesys) Sestrojení standardní přímky. K 0,1 ml standardu v měřící kyvetě přidáme 5 ml činidla Coomassie Brilliant Blue G250. Promícháme a měříme při vlnové délce 595 nm.
Posice v zásobníku:
Stanovení koncentrace bílkovin ve vzorku. K 0,1 ml vzorku přidáme 5 ml činidla, promícháme a měříme. Vzorek vkládáme na pozici 2. Na pozici 1 ponecháme kyvetu „Blank“ z předchozího měření.
Vyhodnocení a závěr Porovnat studované kmeny na základě obsahu bílkovin vztažených na hmotnost sušiny vzorků. Literatura Holme D.J.,Peck,H.(1994). Analytical biochemistry.J.Wiley and Sons, Inc., New York Bradford,M.(1976). A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72:248-254. 9 2.2 Stanovení bakteriální sušiny Úvod Při některých pokusech, zaměřených zejména na studium enzymatické aktivity buněk, je nutné vztahovat naměřené hodnoty na určitou jednotku biomasy. Tímto přepočtem obdržíme hodnoty, které lze mezi sebou srovnávat, třebaže jsou experimenty prováděny v různých časových odstupech nebo na různých mikroorganizmech. V běžné laboratorní praxi je enzymatická aktivita nejčastěji vztahována na sušinu, bílkovinu, dusík apod. Stanovení bakteriální sušiny patří k nejjednodušším metodám umožňujícím porovnání metabolické aktivity mikrobiálních buněk. Tato metoda je však nevhodná pro mikroorganismy s vysokým obsahem lipidů, např.pro některé kvasinky.
Princip metody Sušení biologického materiálu za zvýšené teploty Materiál a zařízení · Mikroorganizmy: Micrococcus luteus, Pseudomonas putida, Escherichia coli, Bacillus cereus, Bacillus subtilis (ze sbírky ústavu) · Materiál: vysušené váženky s víčkem uložené v exikátoru · Chemikálie a roztoky: MPB1; pufr fosfátový ( 0,05M; pH = 7,2); · Přístroje: chlazená centrifuga; fotometr Spekol 11;analytické váhy s přesností 0,1 mg; sušárna
Postup Příprava vzorku.100 ml MPB1 v promývací láhvi naočkujeme 1 kličkou zásobní kultury ze šikmého agaru. Kultivujeme 24 h při 30°C za intenzivní aerace.Takto připravené kultury různých mikroorganizmů centrifugujeme v chlazené centrifuze při 6000 ot.min-1 (teplota +4°C) po dobu 20 min. Supernatant opatrně slijeme, buněčný sediment resuspendujeme ve fosfátovém pufru a znovu centrifugujeme v chlazené centrifuze. Proces promývání buněk opakujeme nejméně dvakrát. Bakteriální sediment ředíme fosfátovým pufrem tak, aby zákal suspenze při λ = 600 nm odpovídal hodnotám cca 80% , 85% a 90%. Přesné hodnoty zákalu buněčné suspenze zaznamenáme. Do připravených vysušených, označených a zvážených váženek pipetujeme po 2 ml buněčné suspenze o odpovídající hustotě ve dvou opakováních. Do dvou váženek pipetujeme pouze fosfátový pufr. Váženky s odklopenými víčky umístíme do sušárny a sušíme při 106°C. Po 24 h váženky vyjmeme, uzavřeme víčko a necháme chladnout při pokojové teplotě v exikátoru. Po zvážení provedeme výpočet podle vztahu: S = (Vs-V)/2 - (Vp-V)/2 (mg/ml), kde Vs je hmotnost váženky s 2 ml bakteriální suspenze V je hmotnost použité váženky Vp je hmotnost váženky s 2 ml fosfátového pufru S je hmotnost bakteriální sušiny v mg/ml bakteriální suspenze 10 Vyhodnocení a závěr Sestrojíme tabulku získaných hodnot.V závěru se zaměříme na odpověď, zda existuje lineární vztah mezi zákalem bakteriální suspenze, koncentrací bílkovin (viz 2.1.) a sušinou. Literatura Hoďák,K.,Němec,M.(1985). Praktikum z fyziologie baktérií. Skriptum UJEP Brno 11 3 Půdní biomasa
3.1 Stanovení půdní biomasy metodou ninhydrin-reaktivního dusíku Úvod Mikrobiální biomasa může být definována jako část organické hmoty v půdě, která je tvořena živými mikroorganizmy menšími než 5-10 µm3. Nejčastěji bývá vyjádřena v miligramech uhlíku obsaženém v jednom kilogramu půdy.Půdní biomasa hraje významnou roli při tvorbě struktury půdy a její stabilitě. Je rovněž významným ekologickým markerem. Ke stanovení půdní biomasy je využívána celá řada metod. Některé jsou založeny na barvení a počítání mikrobiálních buněk, jiné na fyziologických parametrech jako je ATP, respirace a výdej tepla nebo na aplikaci extrakčních technik. Při stanovení biomasy v půdě může být prováděno jednak z hlediska sledování indikátoru mikrobiální biomasy- např. produktu mikrobiálního metabolizmu, který může být kvantitativně extrahován z půdy, jednak z hlediska kvantitativního stanovení celkového dusíku, organického uhlíku, fosforu a dalších složek extraktu získaného z půdního prostředí po usmrcení a lyzi mikrobiálních buněk, jejichž cytoplazma se uvolňuje do prostředí. Z prostředí jsou uvolněné složky biomasy extrahovány. V extraktu lze rovněž stanovit různými kalibračními metodami celkový dusík, anorganický a organický dusík a ninhydrin-reaktivní dusík.
Princip metody Ninhydrin tvoří purpurově zbarvený komplex s molekulami obsahujícími α-aminonodusík, podobně jako s amoniem a jinými sloučeninami s volnou α-aminoskupinou (aminokyseliny, peptidy, proteiny). K vytvoření barevné reakce s amoniem je nutná přítomnost redukovaného ninhydrinu. Množství ninhydrin-reaktivních sloučenin uvolněných z mikrobiální biomasy působením par CHCl3 a následně extrahovaných 0,5M K2SO4 je přímo úměrné koncentraci mikrobiální biomasy v půdě.
Materiál a zařízení · Materiál: vzorek půdy, suchá hmotnost je 50 g · Chemikálie a roztoky: ninhydrin; CHCl3 (obě látky jsou toxické!); 0,5M K2SO4; pufr citrátový; sorbent vody; 95% etanol s vodou (1:1), standard ke stanovení ninhydrin-reaktivního dusíku · Zařízení: vakuová sušička,vývěva, třepačka, mraznička, papírové filtry (Whatman 42), spektrofotometr
Postup Všechny práce provádíme v digestoři s odtahem! Vzorek vlhké půdy o hmotnosti sušiny 50 g rozvážíme po 25 g . Kontrolní vzorek půdy v 250 ml baňce extrahujeme 100 ml 0,5M K2SO4 (poměr extraktantu k hmotnosti vzorku půdy je 4:1 v/w) na třepačce (200 kyvů/min). Po 30-ti minutové extrakci vzorek filtrujeme přes papírový filtr (W42). 12 Další vzorek půdy navážíme do speciální skleněné ampulky o objemu 50 ml a umístíme do sušičky, která je obložena mokrou buničinou. Do prostoru sušičky umístíme lahvičku se sorbentem vody a kádinku obsahující 25 ml CHCl3 se skleněnými kuličkami. Sušičku napojíme na vakuovou pumpu, kterou vypneme cca po 2 min. silného varu CHCl3 . Potom inkubujeme uzavřenou sušičku v temnu při pokojové teplotě po dobu 24 h. Po fumigaci je prostor zavzdušněn a provedeno několikanásobné odsátí zbylých par CHCl3. Vzorek půdy je přenesen do 250 skleněné baňky a podroben extrakci 0,5 M K2SO4 a dalšímu zpracování (stejně jako u kontrolního vzorku). Oba extrakty jsou uchovávány při teplotě -15°C. Do testovací ampulky o objemu 20 ml přidáme tzv. standardní roztoky ke stanovení ninhydrin-reaktivního dusíku, K2SO4- půdní extrakt nebo kontrolní vzorek (0,6 ml). Poté přidáme citrátový pufr (1,4 ml). Po kapkách přidáváme 1 ml ninhydrinu a promícháváme. Nádobka musí být uzavřena hliníkovou zátkou. Testovací nádobku vaříme 25 minut ve vodní lázni. Za tuto dobu by mělo dojít k rozpuštění všech sraženin vzniklých po přidání reagencií. Poté přidáme 4 ml směsi etanol:voda, opět promícháme a měříme zbarvení při vlnové délce 570 nm.
Vyhodnocení a závěr · Výpočet extrahovaného ninhydrin-reaktivního dusíku (Nnin) Nnin(μg.g-1 půdy) = (S - B) : L χ N χ (K:DW + W) χ 1000 S…..absorbance vzorku B…..absorbance blanku L…..molární absorpční koeficient leucinu N….14 (molekulová hmotnost dusíku) K….objem extraktu DW..hmotnost sušiny vzorku v gramech W….vlhkost půdy (%hmotnosti sušiny:100) · Výpočet ninhydrin-reaktivního dusíku v mikrobiální biomase Bnin = (Nnin extrahovaný z fumigované půdy) - (Nnin extrahovaný z kontrolního vzorku)
• Výpočet uhlíku v mikrobiální biomase C = Bnin x 20,6 Pozn.: Uvedený faktor byl vypočten ze vztahu obsahu uhlíku v mikrobiální biomase a hodnot Bnin u 12 vzorků zpracovaných výše uvedenou fumigační extrakční metodou.
Literatura Brookes, P.C., Landman, A., Puden, G., Jenkinson D.S. (1985). Chloroform fumigation and the release of soil nitrogen: a rapid direct extraction method to measure microbial biomass nitrogen in soil. Soil Biol. Biochem 17: 837-842. Vance, E.D., Brookes, P.C., Jenkinson D.S. (1987). An extraction method for measuring soil microbial biomass C. Soil Biol. Biochem. 19: 703-707. Amato, M., Ladd, J.N. (1988). Assay for microbial biomass based on ninhydrin-reactive nitrogen in extracts of fumigated soil. Soil Biol. Biochem. 20: 107-114. Joergensen, R.G., Brookes P.C., Jenkinson, D.S. (1990). Survival of the soil microbial biomass at elevated temperatures. Soil Biol. Biochem. 22: 1129-1136. 13 3.2 Fumigační extrakční metoda pro stanovení fosforu půdní mikrobiální biomasy Úvod Viz kapitola 3.1.
Princip metody K výpočtu obsahu fosforu v půdní mikrobiální biomase používáme rozdílu mezi množstvím fosfátu stanoveného ve fumigované a nefumigované půdě (Fumigace půdy je popsána v kapitole 3.1). Vzhledem k tomu, že některé fosfáty zůstávají po fumigaci sorbovány na koloidní půdní částice, je nutné provádět korekci naměřených hodnot.
Materiál a zařízení · Materiál: vzorek půdy (s malým obsahem jílu), suchá hmotnost 30g · Chemikálie a roztoky: CHCl3 (látka je toxická!); roztok 0,5M NaHCO3 ; pufr citrátový; sorbent vody; 95% etanol s vodou (1:1); roztok KH2PO4 (250 mg fosforu .l-1); činidlo A ; činidlo B; 4,5 M H2SO4; 10M NaOH · Zařízení: vakuová sušička,vývěva, třepačka, mraznička, papírové filtry (Schleicher a Schuell 595 ˝), spektrofotometr, centrifuga
Postup Fumigace a extrakce. Vlhkou půdu (30 g suché hmotnosti) rozdělíme do tří vzorků po 10 g suché hmotnosti. První vzorek bude sloužit jako nefumigovaná kontrola. Tento vzorek umístíme do centrifugační zkumavky o objemu 250 ml a extrahujeme 200 ml roztoku 0,5M NaHCO3 po dobu 30 min za intenzivního třepání (150 kyvů . min-1). Výslednou suspenzi centrifugujeme (2000 g) a pak filtrujeme přes papírový filtr (Schleicher a Schuell 595 ˝). Druhý vzorek (druhá nefumigovaná kontrola výtěžku) umístíme do centrifugační zkumavky o objemu 250 ml a extrahujeme 200 ml roztoku 0,5M NaHCO3 s 1 ml roztoku KH2PO4 , čímž dosáhneme ve vzorku půdy zvýšenou koncentraci fosforu (o 25 µg.g-1). Podobně jako v prvním případě připravíme pro další měření filtrát vzorku. Třetí vzorek fumigujeme podle postupu uvedeného v kapitole 3.1.. Po fumigaci vzorek zpracujeme jako nefumigovanou kontrolu bez přídavku fosforu.
Měření fosfátu. 75 ml půdního extraktu v baňce o objemu 250 ml okyselíme přídavkem 5 ml 4,5M H2SO4 a necháme stát 24 h při +4 °C. Pomocí papírku stanovíme hodnotu pH extraktu. Při hodnotě přesahující pH=1,5 je nutné extrakt dále okyselit 4,5 M H2SO4. Extrakt filtrujeme přes papírový filtr bezprostředně před stanovením anorganického fosforu. Zákal odstraníme centrifugací vzorku. Odebereme 5 ml filtrátu do odměrné baňky o objemu 25 ml. Přidáme 0,4 ml činidla A a 0,8 ml činidla B a doplníme do 25 ml destilovanou vodou. Promícháme a necháme stát cca 10 min při pokojové teplotě. Vytvořené modré zbarvení je stabilní po dobu 24 h. Zbarvení měříme při vlnové délce 882 nm na kalibrovaném fotometru.Vzorek porovnáme s kontrolou. 14 Vyhodnocení a závěr Výpočet fosforu v mikrobiální biomase (P) provedeme podle následujícího vztahu: P = EP/kEP, EP = (F-U) : (Z-U), kde EP je extrahovaný fosfát, F je PO4-P extrahovaný z fumigované půdy, U je PO4-P extrahovaný z nefumigované půdy, Z je PO4-P extrahovaný z nefumigované půdy s přídavkem fosforu a kEP = 0,40 (konstanta). Kalibrace je provedena přidáním známého množství mikroorganizmů do půdy, fumigací a měřením poměru extrahovaného mikrobiálního P. Literatura Joergensen, R.G. (1995). The fumigation extraction method for microbial biomass phosphorus. In: Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Eds. Alef, K., Nannipieri, P., Academic Press London, UK. 394-396. Brookes, P.C., Powlson, D.S., Jenkinson, D.S. (1982). Measurement of microbial biomass phosphorus in soil. Soil. Biol. Biochem. 14: 319-329.
3.3 Stanovení ATP Princip metody ATP se vyskytuje ve všech organizmech a je možné je využít pro stanovení aktivity mikroorganizmů.Tato látka je přítomná v živých organizmech, ale ne v organizmech mrtvých nebo v neživé hmotě. ATP může být extrahován jak z buněk, tak i půdy nebo vody a jeho obsah se stanoví systémem, luciferin-luciferáza. Obsah ATP může být, za určitých podmínek, využit jako parametr mikrobiální biomasy v přirozených vzorcích - půda nebo i voda.
Materiál a zařízení · Mikroorganizmy: vzorky půdy · Chemikálie a roztoky : Pufr EDTA-magnesium arzenátový, extraktant TCA-fosfát-paraquant, směs luciferinluciferáza (Sigma), standardní roztok ATP 10-3M v EDTA-magnesium arsenátovém pufru · Přístroje : Luminometr m90a, pH metr, centrifuga, ultrazvukový dezintegrátor Bandelin UW 200
Postup Příprava vzorku : Vzorek vysušené půdy protlačíme přes síto o velikosti ok 2 mm. Do polypropylenové zkumavky (objem 50 ml) odvážíme 2,5 g homogenizované půdy a vložíme do ledové lázně. Do každé zkumavky přidáme 25 ml studeného extraktantu TCA-fosfátparaquant. Extrakce se provede v ultrazvukovém dezintegrátoru (100W, 2 min, v ledové lázni). Po ozvučení zkumavky vložíme zpět do ledové vodní lázně a po 20 minutách stání v ledové lázni filtrujeme (filtrační papír Whatman No.4). Filtrát dále centrifugujeme (při 10000 rpm min-1, 0oC) po dobu 15 min. Supernatant se potom použije ke stanovení ATP. ATP stanovujeme ihned po centrifugaci nebo vzorek rychle zmrazíme na -15 oC. Ve zmraženém stavu je stabilní po dobu 4 týdnů. 15 Stanovení ATP : V polypropylenové zkumavce (objem 20 ml) smícháme 5 ml EDTA- Mg arzenátového pufru s 50 µl supernatantu a vložíme do ledové lázně. Do měřící kyvety napipetujeme 50 µl směsi luciferin-luciferáza a umístíme do inkubačního bloku Luminometru vytemperovaného na teplotu +25oC a po 10s změříme “relativní světelné jednotky“ (RLU). Potom přidáme 250 µl připraveného supernatantu a po 10s stanovíme RLU. Měření opakujeme třikrát v jednominutových intervalech. Jako blank slouží kyveta obsahující 50 µl EDTA- Mg arzenátového pufru a 250 µl naředěného supernatantu. Měření RLU je prováděno stejným způsoben jako při měření vzorku. Stanovení ATPs : V polypropylenové zkumavce smícháme 5 ml EDTA- Mg arsenátového pufru + 50 µl supernatantu + 50 µl ATP a vložíme do ledové lázně. Do měřící kyvety napipetujeme 50 µl směsi luciferin-luciferáza a umístíme do inkubačního bloku Luminometru vytemperovaného na teplotu +25oC a po 10s změříme RLU. Potom přidáme 250 µl připraveného supernatantu s ATP a po 10s stanovíme RLU. Měření opakujeme třikrát v jednominutových intervalech. Jako blank slouží kyveta obsahující 50 µl EDTA- Mg arsenatového pufru +250 µl naředěného supernatantu+ 50 µl ATP. Měření RLU je prováděno stejným způsobem jako při měření vzorku.
Kalibrační křivka : Pro sestrojení kalibrační křivky použijeme standardních roztoků ATP připravených ředěním ATP v EDTA- Mg arzenátovém pufru v rozsahu 10-5 až 10-8 M (pro sestrojení kalibrační křivky použijeme nejméně 5 koncentrací ATP, přičemž každá koncentrace je ve třech variantách). Měření je prováděno stejným způsobem jako měření vzorku půdy.
Vyhodnocení a závěr Výpočet : Koncentraci ATP ve vzorku půdy stanovíme odvozením z kalibrační křivky a vyjádříme jako množství ATP v µg na g vysušené zeminy. Obsah ATP v půdě je možné stanovit i výpočtem s využitím vnitřního standardu A × ATPs × 40 ATP (µg . g -1 dwt ) = , kde B - A A - RLU/10 půdního extraktu, B - RLU/10 půdního extraktu s přidaným vnitřním standardem ATP (v µg) ATPs - přidané ATP k půdnímu vzorku jako vnitřní standard (v µg) dwt - suchá hmotnost 1 g mokré zeminy 40 - ředící faktor. Literatura : Martens, R. (2001). Estimation of ATP in soil : extraction methods and calculation extraxtion efficiency. Soil.Biol.Biochem., 33 : 973-982 16 3.4 Stanovení půdní respirace Úvod Půdní respirace je charakterizována spotřebou kyslíku (O2) nebo uvolňováním oxidu uhličitého (CO2) v důsledku její mikrobiální aktivity. Zahrnuje výměnu plynů z procesů aerobního a anaerobního metabolizmu. Půdní respirace nás informuje o degradaci biologicky dostupných organických látek a o průběhu jejich mineralizace. Za normálních podmínek existuje ekologická rovnováha mezi půdními organizmy a jejich aktivitou. Jde o tzv. bazální respiraci půdy. Jestliže je tato rovnováha porušena (např. přídavkem degradovatelné organické sloučeniny), dochází k výraznému zvýšení růstu mikroorganizmů a jejich mineralizační aktivity, což se projeví změnou půdní respirace. Půdní respirace může vypovídat o biologické degradaci nejrůznějších látek v půdě, toxicitě některých polutantů v kontaminovaných půdách, o množství mikrobiální biomasy atd..
Princip metody Metoda je založena na měření změn tlaku uvnitř uzavřeného systému v důsledku mikrobiologické respirační aktivity.
Materiál a zařízení · Materiál: vzorek půdy · Chemikálie a roztoky: čočky NaOH · Přístroje: zařízení OxiTop®-Control (WTW, Germany), termobox
17 Postup Příprava a uchovávání půdního vzorku Zpracováváme čerstvé vzorky půdy o vlhkosti 50 ±10%. Vzorek protlačíme přes síto o velikosti ok 2 mm a homogenizujeme. Část homogenizovaného vzorku použijeme pro chemické analýzy (stanovení objemu, iontů apod.). Stanovení objemu vzorku Odměrný válec naplníme 100 ml destilované vody a přidáme 100 g půdního vzorku. Objem vody vytlačený půdním vzorkem představuje objem půdy. Měření půdní respirace Navážíme 200 g půdního vzorku do vzorkové láhve (Duran) o objemu 500 ml. Do víkového adaptéru vložíme gumovou absorbční nádobku s pěti čočkami NaOH a nádobu uzavřeme. Našroubujeme měřící hlavici. Láhev umístíme do termoboxu vytemperovaného na teplotu 20 °C. Půdu temperujeme po dobu dvou hodin. Poté nastartujeme měření vynulováním měřící hlavice současným stisknutím tlačítek S a M. Měření provádíme po dobu 20 dnů jednou denně. Naměřené hodnoty se zobrazí po stisknutí tlačítka M.
Vyhodnocení a závěr Stanovení objemu půdního vzorku vypočteme ze vztahu: V = m/ρ Naměřené hodnoty zaznamenáme do tabulky a vynásobíme faktorem 11. Hodnoty představují mg O2. kg-1půdy. Provedeme výpočet půdní respirace SR.
kde SR je půdní respirace, M(O2) je molekulová hmotnost kyslíku (32000 mg/mol), R je plynová konstanta (83144 l-mbar/mol-K), Tinc je inkubační teplota (293,15 K), Vges je objem reakční nádoby (0,609 litrů), Vsample je je objem vloženého půdního vzorku, ρ je hustota půdy, digit je naměřená hodnota spotřeby kyslíku. Půdní respiraci vyjádříme v mg O2 /kg sušiny. Literatura Anderson, J.P.E., Domsch,K.H. (1978a). Mineralization of bacteria and fungi in chloroform-fumigated soils. Soil Biol.Biochem. 10:207-213. Anderson, J.P.E., Domsch,K.H. (1978b). A physiological method for the quantificative measurement of microbial biomass in soil. Soil Biol.Biochem.10:215-221. 18 3.5 Stimulace půdní respirace přídavkem lehce využitelného substrátu Úvod Viz kapitola 3.1.
Princip metody Přítomnost půdní biomasy lze prokázat stimulací její respirace přídavkem lehce využitelného substrátu, nejlépe glukózy. Metoda přímo vychází z fyziologie půdních mikroorganizmů. Spotřeba kyslíku je průběžně měřena respirometrem.
Materiál a zařízení · Materiál: Vzorky půdy z různých lokalit · Chemikálie a roztoky Roztok stimulační, čočky NaOH, roztok glukózy (16 mg. ml-1) · Přístroje: Zařízení OxiTop® -Control (WTW,Germany), magnetická vícemístná míchačka, termobox
Postup Úprava a preinkubace půdy. Čerstvě odebranou půdu protlačíme přes síto o velikosti ok 4 mm. Prosátou půdu homogenizovanou promícháním nasypeme do inertních nádob ( zaplníme asi 1/3 nádoby) překrytých plastovou fólií. Nádoby s půdou umístíme do temna a inkubujeme po dobu dvou týdnů při teplotě 20°C. Po preinkubaci si vzorky půdy zachovávají bazální respirační aktivitu. Stimulace půdní respirace. Ke stimulaci půdní respirace použijeme půdní vzorek s bazální respirační aktivitou. U vzorku stanovíme hustotu ρ (viz 3.1.) Do vzorkové láhve s bočním ramínkem (Duran) o objemu 500 ml ( reálný objem láhve 0,609 litru) navážíme půdní vzorek tak, aby objem odpovídal 6,7 ml a přidáme 15 ml stimulačního roztoku. Kontrolní vzorek připravíme obdobně. Do láhve s vytvořeným půdn | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
