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Scientific
Publications - Work Done by Microbiology Reader Bioscreen C
Austrian Health Communication, Antibiotika
Monitor - 5/6/2000
Aktivität von Fosfomycin in Kombination mit Ampicillin, Gentamicin, Moxifloxacin, Vancomycin und Teicoplanin gegenüber
Enterokokken mittels Bioscreen-C-Analyzer
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A. Georgopoulos
1, P. Bezecny 1, A. Buxbaum 2, W. Graninger 1
1 Universitätsklinik für Innere Medizin I, Abteilung für Infektionen und
Chemotherapie, AKH Wien
(Vorstand: Univ.-Prof. DDr. W. Graninger)
2 Universitätsklinik für Innere Medizin IV, Abteilung für Pulmologie,
AKH Wien
(Vorstand: Univ.-Prof. Dr. L.H. Block) |
Zusammenfassung
Fünfzig Vancomycin-empfindliche und sechs Vancomycin-resistente
klinische Enterokokken-Isolate wurden mittels
Bouillon-Mikrodilutionsmethode auf ihre Empfindlichkeit gegenüber
Fosfomycin, Ampicillin, Piperacillin-Tazobactam, Ceftazidim, Cefpirom,
Cefepime, Ceftriaxon, Imipenem, Meropenem, Gentamicin, Vancomycin,
Teicoplanin und Moxifloxacin ausgetestet. Fosfomycin MHKs bewegten sich
zwischen 16 und 128 µg/ml und zeigten keine Abhängigkeit vom
Resistenzmuster der Stämme. Um die Aktivität von Kombinationen von
Fosfomycin mit Ampicillin, Gentamicin, Teicoplanin, Vancomycin und
Moxifloxacin zu evaluieren, wurden spektrophotometrische Assays mittels
des Bioscreen-C-Analyzers, eines automatisierten Turbidometers,
durchgeführt. Alle fünf getesteten Antibiotika zeigten in Kombination
mit Fosfomycin einen additiven oder synergistischen Effekt bei der
Mehrzahl der Stämme. Während dieser Effekt bei Vancomycin, Gentamicin
und Moxifloxacin nur schwach ausgeprägt war, zeigte sich eine
deutlichere Wirkung bei der Kombination von Fosfomycin und Ampicillin
oder Teicoplanin. Die effektivste Kombination war hierbei Fosfomycin und
Teicoplanin, die eine synergistische Wirkung bei 44 von 50
Vancomycin-empfindlichen und bei vier von sechs Vancomycin-resistenten
Enterokokken erbrachte. Um die Ergebnisse des Bioscreen-C-Analyzers mit
einer konventionellen Technik zu vergleichen, wurden zusätzliche
Experimente mit der Checkerboard-Technik durchgeführt. Hier zeigte sich
durchwegs gute Korrelation bei den zwei Methoden. Es scheint, dass
spektrophotometrische Messungen eine wertvolle Methode zur
Aktivitätsbeurteilung von Antibiotikakombinationen sein können.
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Key-words:
Fosfomycin, combination, spectrophotometry |
Summary
Fifty vancomycin-susceptible and six vancomycin-resistant clinical
strains of enterococci were tested on their susceptibility to
fosfomycin, ampicillin, piperacillin-tazobactam, ceftazidime, cefpirome,
cefepime, ceftriaxone, imipenem, meropenem, gentamicin, vancomycin,
teicoplanin and moxifloxacin in vitro by the broth microdilution
method. Fosfomycin MICs ranged from 16 to 128 µg/ml and were not
significantly influenced by the antibiotic susceptibility patterns of
the strains. The activity of fosfomycin, a phosphonic acid derivative
with a broad spectrum of bactericidal activity against gram-positive
cocci and several gram-negative bacteria, combined with vancomycin,
teicoplanin, moxifloxacin, gentamicin, and ampicillin was studied in
kinetic spectrophotometric assays using the automatic turbidometer
Bioscreen-C-Analyzer which permits continuous monitoring of bacterial
growth. All six antibiotics provided a synergistic or additive effect in
combination with fosfomycin against most enterococcal strains. While a
weak or moderate beneficial effect was observed with vancomycin,
gentamicin and moxifloxacin, a strong effect was demonstrated if
fosfomycin was combined with teicoplanin and ampicillin. Fosfomycin and
teicoplanin appeared to be the most effective combination and exhibited
synergistic activity against 44 of 50 vancomycin-susceptible and four of
six vancomycin-resistant strains, respectively. To compare the Bioscreen
results with a conventionally used technique, evaluation of antibiotic
combinations was performed also by checkerboard titration. Good overall
correlation between the spectrophotometric assay and the checkerboard
technique could be observed. We conclude that the new approach of
spectrophotometric assessment of antimicrobial combinations using the
Bioscreen-Analyzer could be a valuable alternative for routine
investigations. |
Einleitung
Der Einsatz von Antibiotikakombinationen, um eine ausreichende in
vivo-Aktivität gegenüber einzelnen Antibiotika-resistenten Keimen zu
erreichen, ist Gegenstand zahlreicher Studien auf der ganzen Welt. In
Zeiten ständig steigender Resistenzraten stellt hier die Behandlung von
schweren nosokomialen Infektionen, und insbesondere mit grampositiven
Pathogenen wie Methicillin-resistenten Staphylokokken oder
multi-resistenten Enterokokken, ein besonderes klinisches Problem dar
[1, 2].
Der goldene Standard bei der Therapie von Enterokokken-Infektionen
bleibt die synergistisch wirkende Kombination eines Zellwand-aktiven
Antibiotikums wie z.B. eines ß-Laktames oder eines Glykopeptides mit
einem Aminoglykosid [3]. Unverträglichkeitsreaktionen und die zunehmende
Anzahl von multi- und hochresistenten Enterokokkenstämmen unterstreichen
allerdings die Wichtigkeit der Suche nach neuen Substan-zen oder
Substanzkombinationen mit Anti-Enterokokken-Aktivität.
In dieser Studie wurde die in vitro-Aktivität von Fosfomycin
allein und in Kombination bei Vancomycin-empfindlichen und
Vancomycin-resistenten klinischen Isolaten von Enterococcus faecalis
und Enterococcus faecium bestimmt. Dazu wurde eine neue
spektrophotometrische Methode – der Bioscreen-C-Analyzer, der kinetische
Bestimmungen erlaubt – verwendet [4]. Zur Evaluierung dieser Methode
wurden ebenfalls Bestimmungen mit der Standardmethode – der
Checkerboard-Technik – durchgeführt. |
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Material und Methode
Bakterienstämme und Medien
56 Enterokokkenstämme (41 Vancomycin-empfindliche E. faecalis,
sechs Vancomycin-resistente E. faecalis, neun E. faecium)
wurden für die Experimente verwendet. Alle Stämme waren klinische
Isolate aus Blut, Urin, Sputum oder BAL; als Referenzstamm wurde E.
faecalis ATCC 29212 mitgetestet. Als Wachstumsmedium wurde
Mueller-Hinton-Bouillon verwendet, für die Fosfomycin-Tests wurde
Glucose-6-Phosphat zugegeben.
Antibiotika
Folgende Substanzen wurden getestet: Fosfomycin, Ampicillin,
Piperacillin/Tazobactam, Cefpirom, Ceftazidim, Ceftriaxon, Cefipime,
Gentamicin, Imipenem, Meropenem, Teicoplanin, Vancomycin und
Moxifloxacin. Stammlösungen der Substanzen wurden hergestellt und in
flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Am Tag des Experimentes wurden die
Substanzen aufgetaut und entsprechende Verdünnungen hergestellt.
Minimale Hemmkonzentrationen (MHK)
Die Bestimmung der MHKs erfolgte mittels Bouillon-Mikrodilutionsmethode
nach NCCLS-Kriterien [5].
Bestimmung der Aktivität von antibiotischen Kombinationen
Die Aktivität von Kombinationen von Fosfomycin mit Vancomycin,
Teicoplanin, Gentamicin, Ampicillin und Moxifloxacin erfolgte nach zwei
verschiedenen Methoden:
1) Checkerboard-Technik
Hierbei wurden die sechs Vancomycin-resistenten E. faecalis- und
fünf Vancomycin-empfindliche E. faecalis-Stämme getestet.
Bakterielle Kulturen wurden in Mueller-Hinton-Bouillon angelegt und in
Gegenwart von Antibiotikakombinationen über Nacht bebrütet. Der
fractional inhibitory index (FIC) wurde berechnet und wie folgt
angegeben:
additiv:
0,5 < FICA + FICB
<= 1,0
indifferent:
1,0 < FICA + FICB
<= 2,0
synergistisch:
FICA + FICB
<= 0,5
antagonistisch:
FICA + FICB
> 2,0
2) Bioscreen-C-Analyzer
Diese Methode basiert auf turbidometrischen Messungen von bakteriellen
Kulturen während der Inkubation mittels eines automatisierten Gerätes,
dem Bioscreen-C-Analyzer. Hierbei werden serielle Verdünnungen von mit
verschiedenen Antibiotika-Konzentrationen inkubierten
Bakteriensuspensionen hergestellt und nach Inkubation das bakterielle
Wachstum kontinuierlich gemessen. Die Ergebnisse werden als
Wachstumskurven und als berechnete Werte dargestellt. Unter Einbeziehung
der area under the curve (AUC) können folgende Definitionen erstellt
werden [1]:
additiv:
AUC(A+B) ± 10% =
AUCA x AUCB
/ AUC0
indifferent:
AUC(A+B) ± 10% =
AUCA oder AUCB
synergistisch:
AUC(A+B) + 10% <
AUCA x AUCB
/ AUC0
antagonistisch:
AUC(A+B) – 10% >
AUCA oder AUCB
AUC0, AUCA,
AUCB, und AUC(A+B)
stellen die AUC0-16
Werte dar, die ohne Antibiotikum (AUC0),
mit Antibiotikum A (AUCA),
Antibiotikum B (AUCB)
oder mit den Antibiotika A und B (AUC(A+B))
erzielt wurden. |
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Ergebnisse
MHK
Die Ergebnisse der MHK-Bestimmungen der getesteten Antibiotika sind in
Tabelle 1 zusammengefasst. Neun Stämme waren Fosfomycin-empfindlich (MHK
<= 32 µg/ml), 32 Stämme intermediär-empfindlich (MHK = 64 µg/ml) und
neun Stämme resistent (MHK >= 128 µg/ml). In der Gruppe der ß-Laktame
zeigte sich Ampicillin als die wirksamste Substanz. Drei
Enterokokkenstämme waren multi-resistent, wobei sich jedoch keine
Korrelation zwischen Resistenz gegenüber Fosfomycin und den anderen
getesteten Antibiotika zeigte.
Tabelle 1: MKH-Werte der getesteten Substanzen gegenüber
klinischen Enterokokkenisolaten
|
Substanz |
|
|
|
|
Fosfomycin |
|
Ampicillin |
|
Piperacillin/Tazo. |
|
Ceftazidim |
|
Cefpirom |
|
Cefipime |
|
Ceftriaxon |
|
Imipenem |
|
Meropenem |
|
Gentamicin |
|
Moxifloxacin |
|
Vancomycin |
|
Teicoplanin |
|
|
<= 32
|
>= 128
|
|
<= 8
|
>= 16
|
|
<= 8/4
|
>= 16/4
|
|
<= 8
|
>= 32
|
|
<= 8
|
>= 32
|
|
<= 8
|
>= 32
|
|
<= 8
|
>= 64
|
|
<= 4
|
>= 16
|
|
<= 4
|
>= 16
|
|
<= 256
|
>= 512
|
|
<= 2
|
>= 8
|
|
<= 4
|
>= 32
|
|
<= 8
|
>= 32
|
|
|
9
|
25
|
7
|
|
40
|
0
|
1
|
|
37
|
0
|
4
|
|
1
|
3
|
37
|
|
3
|
20
|
18
|
|
3
|
1
|
37
|
|
5
|
0
|
36
|
|
37
|
0
|
4
|
|
23
|
14
|
4
|
|
32
|
0
|
9
|
|
32
|
1
|
8
|
|
40
|
1
|
0
|
|
41
|
0
|
0
|
|
|
0
|
7
|
2
|
|
3
|
0
|
6
|
|
2
|
0
|
7
|
|
1
|
0
|
8
|
|
1
|
1
|
7
|
|
0
|
1
|
8
|
|
1
|
0
|
8
|
|
2
|
0
|
7
|
|
2
|
0
|
7
|
|
6
|
0
|
3
|
|
2
|
2
|
5
|
|
9
|
0
|
0
|
|
9
|
0
|
0
|
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Aktivität der Antibiotika-Kombinationen
Die Ergebnisse des Bioscreen-C-Analyzers sind in den Tabellen 2 und 3
und den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. Alle sechs Substanzen zeigten
in Kombination mit Fosfomycin einen additiven oder synergistischen
Effekt. Als wirksamste Kombination erwies sich hierbei Fosfomycin und
Teicoplanin mit einem synergistischen Effekt bei 44 von 50 Isolaten.
Tabelle 2: Aktivität von Fosfomycin in Kombination bei
Vancomycin-empfindlichen E. faecalis (A, n=41) und E.
faecium (B, n=9)
|
Effekt |
F + VAN
|
|
F + TEC
|
|
F + GEN
|
|
F + MOX
|
|
F + AMP
|
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A
|
B
|
A
|
B
|
A
|
B
|
A
|
B
|
A
|
B
|
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synergistisch |
25
|
1
|
|
37
|
7
|
|
24
|
1
|
|
27
|
3
|
|
32
|
7
|
|
additiv |
0
|
0
|
|
0
|
1
|
|
7
|
1
|
|
5
|
1
|
|
3
|
0
|
|
indifferent |
16
|
8
|
|
4
|
1
|
|
10
|
6
|
|
9
|
5
|
|
6
|
2
|
|
antagonistisch |
0
|
0
|
|
0
|
0
|
|
0
|
1
|
|
0
|
0
|
|
0
|
0
|
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F = Fosfomycin, VAN = Vancomycin, TEC = Teicoplanin, GEN =
Gentamicin, MOX = Moxifloxacin, AMP = Ampicillin |
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Tabelle 3: MHKs der getesteten Substanzen und Aktivität der
Antibiotika-Kombinationen bei Vancomycin-resistenten Enterokokken
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MHK (µg/ml)
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F
|
VAN
|
TEC
|
GEN
|
MOX
|
AMP
|
|
|
Effekt der Kombination
|
|
F+VAN
|
F+TEC
|
F+GEN
|
F+MOX
|
F+AMP
|
|
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VREF 34 |
64
|
256
|
64
|
256
|
16
|
2
|
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VREF 219 |
32
|
256
|
16
|
256
|
8
|
2
|
|
VREF 277 |
32
|
256
|
32
|
16
|
0,25
|
2
|
|
VREF 293 |
32
|
256
|
64
|
256
|
16
|
2
|
|
VREF 294 |
64
|
256
|
64
|
256
|
8
|
2
|
|
VREF 304 |
64
|
256
|
128
|
256
|
16
|
1
|
|
|
A
|
S
|
S
|
I
|
A
|
|
S
|
S
|
I
|
A
|
A
|
|
I
|
A
|
A
|
I
|
S
|
|
A
|
S
|
A
|
I
|
I
|
|
A
|
A
|
A
|
S
|
S
|
|
S
|
S
|
S
|
S
|
A
|
|
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F = Fosfomycin, VAN = Vancomycin, TEC = Teicoplanin, GEN =
Gentamicin, MOX = Moxifloxacin, AMP = Ampicillin A = additiv, I
= indifferent, S = synergistisch |
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Abbildung 1: Aktivität von Fosfomycin in Kombination mit
Teicoplanin: Bioscreen-Analyse
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Abbildung 2: Aktivität von Fosfomycin in Kombination mit
Gentamicin: Bioscreen-Analyse
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Vergleich von Checkerboard-Technik und Bioscreen-C-Analyzer
Bei 72 Tests wurden 50 übereinstimmende und 22 abweichende Ergebnisse
erzielt. Die 22 divergierenden Ergebnisse zeigten im Checkerboard: 19 x
additiv (Bioscreen: 10 synergistisch, 9 indifferent), 2 x indifferent
(Bioscreen: additiv) und 1 x synergistisch (Bioscreen: additiv).
Insgesamt konnte eine gute Korrelation erreicht werden. |
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Diskussion
Die Ziele dieser Studie waren zweifach: i) die Suche nach der
antibiotischen Kombination mit der größten Anti-Enterokokken-Aktivität
ii) die Evaluierung des kinetischen Bioscreen-Assays als
Routine-Screening-Methode.
Die Bestimmung des FIC mit der Checkerboard-Methode hat Nachteile:
sie ist zeit- und materialaufwändig und liefert keine kinetischen
Ergebnisse (Wachstum der bakteriellen Kultur über die Zeit). Damit ist
die Grundvoraussetzung für die Anwendung dieser Methode das Vorliegen
einer linearen Dosis-Wirkungs-Kurve für jede einzelne Substanz. Im
Gegensatz dazu liefert eine spektrophotometrische Methode wie der
Bioscreen-Assay eine ständige Aufzeichnung des bakteriellen Wachstums.
In einem Ansatz können 200 Proben (mit verschiedenen Antibiotika)
gemessen werden. Für diese Studie wurde der Berechung des FIC die
AUC0-16 zugrunde gelegt. Damit wurde dem Problem Rechnung getragen, dass
durch eine längere Inkubationszeit sowohl die verzögerte antimikrobielle
Wirkung von Substanzen wie Ampicillin berücksichtigt wird, als auch eine
Unterscheidung zwischen einer lag Phase durch Wachstumsinhibition und
dem bakteriellen Killing ermöglicht wird [4].
Es erwies sich der Bioscreen-Assay als durchaus taugliche Methode für
das rasche Screening von antibiotischen Kombinationen in der Routine.
Der Vergleich mit den Ergebnissen der Checkerboard-Methode zeigte eine
gute Korrelation. Divergierende Ergebnisse sind auf unterschiedliche
Definitionen der beiden Methoden zurückzuführen (additiv: Summe der
Resultate der einzelnen Substanzen im Checkerboard vs. kombinierte
Aktivität der einzelnen Substanzen im Bioscreen-Assay).
Einige Autoren beschäftigten sich mit der Interaktion von Fosfomycin mit
anderen Zellwand-aktiven Substanzen. Hierbei zeigte sich nur eine
geringe Kreuzresistenz zwischen Fosfomycin und anderen Substanzklassen
wie ß-Laktamen oder Aminoglykosiden [6, 7, 8]. Ebenso wurden
synergistische Effekte von Fosfomycin und ß-Laktamen und Fosfomycin und
Daptomycin gegenüber Enterokokken beobachtet. In dieser Studie lagen die
MHK50 und MHK90 der getesteten Enterokokkenisolate bei 64 und 128 µg/ml;
weiters zeigte sich kein Zusammenhang zwischen Resistenz gegenüber
Fosfomycin und Resistenz gegenüber den anderen Substanzen [9, 10]. Als
am wirksamsten erwies sich die Kombination von Fosfomycin mit
Teicoplanin oder Ampicillin, unabhängig vom Resistenzmuster der
einzelnen Stämme [8, 9, 11]. Diese Kombinationen scheinen den
Kombinationen von Fosfomycin und Aminoglykosid oder Quinolon deutlich
überlegen zu sein. Aus diesem Grunde sollte die Kombination von
Fosfomycin mit Teicoplanin oder einem ß-Laktam wie Ampicillin als
Therapiealternative bei der Behandlung von schweren
Enterokokkeninfektionen in klinischen Prüfungen evaluiert werden.
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|
Literatur:
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Anschrift des
Verfassers:
Univ.-Prof. DDr. A. Georgopoulos
Univ.-Klinik für Innere Medizin I, Abt. für Infektionen und
Chemotherapie
A-1090 Wien, Währinger Gürtel 18-20 |
|
(Full Text online)
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